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体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌细胞的诱导分化

吴铁军  
【摘要】:心肌梗死后心肌细胞数量大量减少、瘢痕形成是影响心功能的重要因素,细胞移植成为治疗心肌梗死的新策略。多种细胞可以作为细胞移植治疗的种子细胞。骨髓间质干细胞(MSCs)是一种具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞群,MSCs易于获取及体外培养,适合自体移植,使之成为细胞治疗的合适种子细胞。研究MSCs定向分化为心肌细胞机制对细胞移植治疗心肌梗死有重要的理论和临床意义。本实验通过对培养的大鼠骨髓间质干细胞行体外药物诱导以及与心肌细胞的共同培养促其向心肌细胞分化并鉴定,探讨体外药物诱导、分化的条件、规律和特点,通过共同培养观察心肌细胞对MSCs的生长特性的影响,分析心肌细胞对MSCs的诱导分化作用,为心肌内MSCs移植提供理论依据。 方法: 1.药物诱导:Percoll液密度梯度法分离MSCs进行体外培养,观察其生长特性;分别使用终浓度为1、5、10、20umol·L~(-1)的5-氮胞苷(5-aza)对其定向诱导,观察细胞形态学的变化,体外诱导4w后,荧光免疫细胞化学方法检测肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin43的表达,透射电镜观察诱导后细胞的超微结构,比较不同浓度药物对MSCs体外向心肌细胞诱导分化的影响。 2.共同培养:在体外分别分离、提纯成年鼠骨髓间质干细胞和新生鼠的心肌细胞,利用PET膜作为支架,两种细胞以1:1细胞数分别接种于PET膜两侧,与心肌细胞分离的条件培养和单独培养作对照,观察MSCs生长特性;共同培养2w后收集诱导分化的细 第四军医大学硕士学位论文 胞,荧光免疫细胞化学方法检测肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin43 的表达,透射电镜观察诱导后细胞之间的连接。 结果MSCs体外贴壁生长,呈成纤维细胞样形态,经5一aza诱 导后细胞体积增大,变为球状或者长杆状,4w后荧光免疫细胞化 学方法检测肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin43表达阳性, 10umol·L一‘5一aza组及20umoz·L一’5一aza组阳性表达较高,但 20umol·L一‘5一aza组约50%细胞死亡。电镜下可以见到细胞内排列 紊乱的肌丝,部分可以形成不典型的肌节样结构,并可以见到z 线,在部分细胞间形成缝隙连接。在共同培养实验中,共同培养 组诱导MSCS表达肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin43,而与心肌细 胞分离的条件培养组没有观察到MSCS的分化。 结论 1.MSCs可以在体外经5一氮胞昔诱导分化为心肌细胞,以 10umol·L一‘5一aza.的浓度诱导作用最好。 2.MSCs与心肌细胞共同培养可以诱导MSCs定向分化为心肌细胞, 而与心肌细胞分离的条件培养组没有观察到MSCs的分化。 3.心肌微环境对MSCs具有诱导分化作用,细胞间的接触在分化过 程中起到很大作用。 4.MSCs易于获取及体外培养,适合自体移植,是一种细胞移植治 疗的合适种子细胞。


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