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兔骨髓间质干细胞在体外正常及病理心肌细胞微环境中的定向分化

张薇  
【摘要】:骨髓间质干细胞(MSCs)是一种骨髓来源的具有多相分化能力的干细胞,国内外的体内外实验已经证明,其在不同的环境及条件下可以定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞等多种细胞。由于其取材方便,体外易扩增培养,能够自体移植进行相应的组织器官修复,有着非常诱人的临床应用前景,是近年来倍受瞩目的组织工程干细胞材料。本实验采集兔骨髓间质干细胞,体外扩增培养,并经5—氮杂胞苷诱导后观察其在正常心肌细胞微环境中的定向分化情况,探讨MSCs定向分化的可能机制,并观察MSCs在经阿酶素损伤后的心肌细胞所构成的病理性微环境中能否分化为心肌细胞或心肌样肌细胞,为MSCs移植治疗心肌病的临床应用提供理论依据。本实验进行了以下几方面的研究: 1、经过反复实践,摸索出相对简便有效、实用的兔骨髓间质干细胞体外收集、分离、扩增培养技术:骨髓液密度梯度离心 第四军医大学硕士学位论文 得到骨髓间质干细胞,所得细胞经流式细胞仪检测细胞表面抗 原,结果显示细胞均一性较好,抗原CD34阴性,CD44阳性,表 明所得为较纯的骨髓间质干细胞。 2、骨髓间质干细胞体外与仔鼠正常心肌细胞共培养时的定 向分化:体外分离培养兔骨髓间质干细胞,经5一氮杂胞昔诱导 和DAP工标一记后,与体外培养的仔鼠心肌细胞一起共培养,分别 在共培养后的第14、21、28d,采用透视电镜观察超微结构、免 疫细胞化学方法鉴定,并用流式细胞仪检测a一sarcomeric aCtin阳性或DAPI和Cy3双阳性细胞所占百分比。取仅经5一氮 杂胞普诱导的的骨髓间质干细胞作为对照组。结果14d时直接接 触组内即可见个别DAPI标记的MSCsQ一sarC0meriC aCtin、 desmin免疫荧光反应阳性,21、28d时共培养组和对照组均见小 部分免疫荧光阳性的MSCS细胞。电镜观察可见横纹样结构形成, 核呈卵圆形,位于细胞中央,胞质中可见富集的糖原颗粒和肌丝。 流式细胞仪检测结果示直接接触组中双阳性细胞百分比高于其 余两组,电镜示超微结构更加成熟。 3、骨髓间质干细胞体外与阿霉素损伤的心肌细胞共培养时 的定向分化:体外分离培养兔骨髓间质干细胞,经5一氮杂胞昔诱 导和DAP工标记后,与阿霉素预处理的乳鼠心肌细胞一起共培养, 取共培养后14、21、28d的细胞进行相关检测。结果显示21、28d 时MilliCell组和对照组可见小部分a一sareomeriC aetin、 desmin阳性细胞,直接接触组内DAPI标记的MSCS细胞部分免疫 荧光反应阳性。电镜观察可见横纹样结构形成,细胞具有部分肌 细胞特征。流式细胞仪检测结果示直接接触组中双阳性细胞百分 比高于其余两组,电镜示超微结构更加成熟。 本实验结果表明体外分离培养的兔骨髓间质干细胞有很强 的可塑性,预先经5一氮杂胞营诱导后,在体外正常和阿霉素损 伤所导致的病理性心肌细胞微环境中均可顺利分化为心肌样细 第四军医大学硕创匕学位论文 胞,且同细胞液相关因子相比,细胞间的直接接触对MSCS的定 向分化有更重要的作用。这些结果进一步证实骨髓间质干细胞具 有多向分化潜能,是组织修复工程的一颗新星,可能成为心血管 疾病的一种全新的治疗手段,并为其相关临床应用提供了实验基 础。


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