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腺病毒介导的hBMP-7基因治疗骨缺损的实验研究

鱼兵  
【摘要】:目的 克隆人骨形成蛋白7基因全长并以AdEasy腺病毒表达系统制备携带BMP-7基因的高滴度腺病毒,感染兔骨髓基质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达成骨细胞表型。再将转染的MSCs与高分子生物材料PLGA支架相复合,在体外构建组织工程化骨,移植修复兔自体桡骨缺损,观察该方法的可行性和有效性,以期找到一种较好的修复骨缺损的方法。 方法 (1)采用逆转录PCR方法自人胎盘组织提取的总RNA中扩增获得BMP-7基因,经测序后与Genbank中序列进行比较分析。(2)将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7。(3)采用密度梯度离心法自骨髓中分离培养兔骨髓基质干细胞,观察原代及传代MSCs形态特点、生长特性和特殊染色,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。(4)以复制缺陷重组腺病毒介导人BMP-7基因转染MSCs后,以MTT法及流式细胞仪观察转染对细胞增殖活力及细胞周期的影响;用RT-PCR法、免疫组化染色以及Westernblot证实转基因MSCs的BMP-7蛋白和I


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