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采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因的研究

崔大祥  
【摘要】:在本实验中,运用mRNA DD-PCR技术,以细胞株GC7901与GES-1为研究对象,采用Liang与Pardee改进的第三代引物,摸索并建立了差示PCR的优化条件,建立的条件为:前5轮采用94℃35S,40℃ 2min,72℃ 30S,后35轮循环采用94℃35S,55℃ 2min,72℃ 1min,最后在72℃延伸7min。运用建立的条件,进行了差示PCR,扫描确定并分离回收了差异条带154条,胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有82条;胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有35条;胃癌细胞株泳道中表达高于胃粘膜细胞株泳道中的有23条;胃粘膜细胞株泳道中表达高于胃癌细胞株泳道中的有14条;分别来自于H-T_(11)G、H-T_(11)C、H-T_(11)A锚定引物的差异条带为61条、47条、46条。 从筛出的片段中随机挑取了17个差异条带(命名为GCYS-1至17)作探针,与细胞株GC7901及GES-1总RNA进行打点杂交,结果证实17个片段在两个细胞株之间呈差异表达。采用PCR产物直接测序及全自动测序技术获取了17个差异片段序列,利用计算机网络对序列进行GenBank同源性检索分析,发现GCYS-4、5、6、13四个序列为新序列,其余13个序列与GenBank中序列有部分同源,其中GCYS-17序列与HEK-5 3’端序列有97%同源性,与ERK序列有97%同源性。 针对获取的序列重新设计了16对引物,第17对引物采用ERK引物,计算机分析表明这17对引物具有特异性。利用RT-PCR方法对细胞株、新鲜组织标本、血标本进行了检测。结果表明:通过对GES-1及GC7901细胞


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