人成骨蛋白-1成熟肽基因的克隆和序列分析、5’端修饰及其在大肠杆菌中的表达

【摘要】：成骨蛋白-1(OP-1)，亦即骨形成蛋白-7(BMP-7)，是TGF-β家族的成员之一，属于Dpp-Vg1亚家族，与BMP-5、-6、-8(OP-2)关系最为密切。OP-1的cDNA全长1878bp，ORF1296bp，编码431个氨基酸的多肽，以前体蛋白的形式分泌。包括N端的信号肽、中间的前肽、C端的成熟肽三部分，翻译后的前体需要进一步加工修饰，包括切掉信号肽和前肽。OP-1的成骨活性主要表现在其羧基端成熟肽部分，这与TGF-β家族成员具有很大的相似性，它们在成熟肽部分保持很高的同源性，尤其是在TGF-β结构域，7个半胱氨酸的位置是绝对保守的。成熟的OP-1具有诱导骨形成的作用，能够促进各种骨缺损的修复和牙周重建，OP-1也能促进修复性牙本质、牙骨质的形成，还对脑缺氧或缺血有神经保护作用，此外，OP-1还在胚胎发育中起着重要的调节作用，因此。具有十分乐观的临床前景。由于天然OP-1的缺乏和提取困难，基因工程重组人OP-1(rhOP-1)已成为满足其研究和临床需要的唯一可靠来源，目前国外对rhOP-1的理论研究和临床应用研究已相当深入，hOP-1的全长cDNA已在真核系统获得表达，但昂贵的成本和极低的表达量远不能满足需要。尽管大肠杆菌表达系统缺乏蛋白质的翻译后加工能力，并可能潜在地影响表达蛋白质的稳定性、抗原性、生物学活性等，但大肠杆菌表达系统所具有的低成本、高产量等优点则是其它体系无法比拟的，因此仍是目前最常用的外源基因表达系统，国外已见到用大肠杆菌表达OP-1突变体的个别报道。在我国，关于OP-1的研究尚未起步。为启动和促进我国对hOP-1的研究，本研究对中国人OP-1成熟肽基因进行了克隆、序列分析、5’端修饰和原核表达，并观察了rhOP-1对体外培养的牙髓细胞骨钙素和碱性磷酸酶的影响。 采用一步酸酚法从中国健康人胎盘组织中提取总RNA，用RT—PCR技术直接从胎盘cDNA单链库中扩增出中国人OP-1成熟肽基因