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人白细胞介素-3的基因工程表达及其产物分离纯化的研究

杨立宏  
【摘要】:人白细胞介素-3(human Interleukin 3,hiL-3)是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用PCR方法从人T淋巴细胞cDNA文库中扩增出0.44bp的DNA片段,序列分析后确定含有完整的hiL-3成熟蛋白编码顺序,并在信号肽与成熟蛋白编码顺序之间突变入了限制性内切酶位点和ATG起始码。构建的P_L启动子控制下的hiL-3cDNA表达质粒,转入大肠杆菌后经培养、诱导获得hiL-3高效表达,表达量约占细茵总蛋白的15%左右。进一步设计合成了多个寡核苷酸引物,对hiL-3cDNA 5′端和翻译起始区进行了改造,使hiL-3表达水平提高到占菌体总蛋白30%左右。对所获得的工程菌E.coli Tap106/pSBHL-11进行了初步发酵,最高获得湿菌重为24.4g/L。建立了简单有效的分离纯化方法,纯化后hiL-3纯度达95%以上,比活为1.2×10~7u/mg,总回收率为28.2%对所表达的hiL-3进行了ELISA、Western-blot、等电点聚胶分析和N端16个氨基酸顺序分析。本文还初步讨论了T_7噬菌体g10翻译增强子对hiL-3基因在大肠杆菌中表达的影响,初步在酵母中分泌表达了hiL-3基因,初步在大肠杆菌中表达了hiL-3与hiL-11的融合基因。


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