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MMP-2,MMP-9和TIMP-2启动子区基因多态性与侵袭性牙周炎相关性的研究

陈栋  
【摘要】: 牙周病是一类涉及到细菌微生物侵犯和宿主反应等因素影响的常见病之一;细菌是牙周炎的始动因素,但是细菌的作用可能会被宿主反应不同所改变。侵袭性牙周炎是常发生在全身健康的青少年和年轻成年人、以牙周支持组织快速降解破坏为特征的一类牙周炎;大量的遗传学研究认为罹患侵袭性牙周炎的个体涉及遗传易感因素。 迄今大多数遗传基因易感因素和牙周病相关性研究主要采用候选基因多态性(polymorphisms)的关联研究;已有研究多关注免疫系统和炎性因子的基因,包括白介素-1(IL-1),人类白细胞抗原(HLA),维生素D受体,Fcγ受体等基因;实际上炎性因子刺激宿主细胞产生过量的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs),最终导致了牙周组织的降解和破坏。MMPs家族是由20多种锌离子依赖性内切酶组成,在胚胎发育、炎症反应和肿瘤侵袭转移等中发挥重要作用;尤其在炎症反应中加速白细胞募集、细胞因子释放和促进基质降解改建。明胶酶是MMPs家族的主要成员,包括MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B);它们作用底物广泛,包括IV型胶原、明胶、弹性蛋白等。MMP-2主要由成纤维细胞、内皮细胞和破骨细胞表达;MMP-9主要由中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞产生。MMPs的表达活化受到转录调控、底物特异性、内源性抑制剂—组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)三方面的平衡调节。大量临床研究证实在牙周炎活跃期的龈沟液、牙龈中包括MMP-2、MMP-9在内的MMPs水平明显升高,MMPs/TIMPs比例失衡。 近年来国内外学者发现在不同种族中MMP-1启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与慢性牙周炎或侵袭性牙周炎易感性有一定相关性。促使人们把目光投向非炎症系统的MMPs家族基因作为候选基因,探寻其基因多态性和牙周炎的关系。近来在MMP-2基因启动子区发现-1306bp位点胞嘧啶替换为胸腺嘧啶(C→T)形成SNP,改变了CCACC盒而影响转录水平;在MMP-9启动子区-1562bp位点C→T产生的SNP对转录也产生显著影响,T等位基因表达水平升高;TIMP-2基因启动子区-418bp位点上鸟嘌呤转换为胞嘧啶(G→C),影响到Sp1结合位点导致TIMP-2基因转录水平的下调,进而可能影响到TIMP-2和MMP-2之间的平衡。本课题将对MMP-2,MMP-9和TIMP-2启动子区基因多态性与侵袭性牙周炎相关性进行研究。 牙周专科电子病历是对牙周病临床病例样本进行牙周临床指标统计分析的理想工具,对牙周临床科研工作的开展起着不可替代的作用。随着牙周病学研究的快速发展和口腔数字化管理的普及,亟需牙周专科电子病历,加快国内牙周电子病历的研制开发势在必行。为此本课题开发构建了牙周专科电子病历。 本课题还利用临床搜集的AgP患者牙龈组织标本,应用免疫组织化学法对MMP-9、TIMP-2的表达进行定位及半定量分析,探讨了MMP-9、TIMP-2在侵袭性牙周炎不同基因型牙龈组织中的表达情况。 第一部分牙周电子病历的构建 本研究采用微软IIS(Internet Information Server)的ASP(Active Server Page)服务器脚本语言和ACCESS数据库,实现了牙周临床指标数据录入统计和牙周健康状况全景形象展示,较为全面细致地反映患者牙周状况,可以满足牙周专科和本课题临床病例牙周指数统计的需要,为发展国内牙周专科电子病历做出有益探索。 第二部分MMP-2,MMP-9和TIMP-2启动子区基因多态性与侵袭性牙周炎相关性研究 研究样本为79名广泛型侵袭性牙周炎(generalized aggressive periodontitis,G-AgP)患者和128名临床牙周健康对照者;本研究样本的检验效能为75%,样本量大小符合检测效能的要求。Chelex-100法从颊拭子脱落细胞中提取DNA,采用聚合酶链反应-变性高效液相色谱法(denaturing high- performance liquid chromatography,DHPLC)和限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism , RFLP)法分别检测样本MMP-2-1306bpC/T,MMP-9-1562 C/T和TIMP-2-418G/C启动子区基因多态性;分析两组中基因型分布、等位基因频率,以及MMP-2和TIMP-2复合基因单体型。 结果:Chelex-100法所提取DNA完全可以满足本实验候选基因的SNP检测;G-AgP组和对照组按照年龄和性别t检验p = 0.157和0.124,两组的性别、年龄匹配。经卡方检验两组中MMP-2,-9,和TIMP-2基因型符合哈代-温伯格平衡(Hardy-Wenberg equilibrium)(χ2= 0.001~0.83,p0.05)。卡方检验均经过耶茨校正(Yates’correction),多重卡方检验校正p0.017为有显著性意义。MMP-2-1306C/T、MMP-9-1562C/T启动子区基因多态性在G-AgP组和对照组中最常见的基因型为CC,而TT基因型少见,各基因型在两组的分布没有差异(p0.05)。等位基因频率在两组中也没有显著性差异(p=0.707,0.858)。TIMP-2启动子区基因多态性在G-AgP组和对照组中基因型和等位基因频率的分布:在G-AgP组GC+CC基因型(48.1%)比对照组(32.0%)明显增多[p = 0.030; OR: 1.97, 95% CI: (1.11;3.50)],这种差异经过多重卡方检验校正后失去显著性意义(p0.017);TIMP-2-418G和-418C等位基因频率在G-AgP组分别为71.5%和28.5%,而在对照组分别为82.4%和17.6%,等位基因-418C在G-AgP组的检出频率显著高于对照组[p=0.013; OR: 1.87, 95% CI: (1.17;2.99)]。MMP-2和TIMP-2复合基因单体型分析以常见的MMP-2-1306 CC+TIMP-2-418GG基因型作参照,两组中复合基因型分布差异没有显著性意义(p0.05),即没有显示出MMP-2和TIMP-2复合基因的叠加作用和我国汉族人群侵袭性牙周炎有相关性。 结论:MMP-2-1306C/T、MMP-9-1562C/T启动子区基因多态性可能不是我国汉族人群侵袭性牙周炎的遗传易感因素;TIMP-2-418G/C启动子区基因多态性与我国汉族人群广泛型侵袭性牙周炎有相关性,TIMP-2-418C等位基因可能是我国汉族人群广泛型侵袭性牙周炎的遗传易感因素。 第三部分MMP-9, TIMP-2在不同基因型侵袭性牙周炎患者牙龈组织中的表达 本部分对6例健康牙龈标本和9例AgP患者牙龈标本,应用免疫组织化学染色法,按照MMP-9-1562bpC/T、TIMP-2-418G/C不同基因型分组,观察牙龈组织中MMP-9、TIMP-2的表达,目的在于分析MMP-9、TIMP-2在侵袭性牙周炎不同基因型的龈组织表达情况。 结果:在正常牙龈标本中MMP-9和TIMP-2几乎不表达,而在侵袭性牙周炎患者的牙龈组织中MMP-9和TIMP-2表达明显。MMP-9主要在固有层炎性细胞密集区阳性表达;TIMP-2多在上皮层表达。在病例组,含有MMP-9-1562T等位基因和不含MMP-9-1562T等位基因的牙龈组织中MMP-9表达阳性细胞数量和平均灰度值无显著差别;不含TIMP-2-418C等位基因的牙龈组织中TIMP-2表达阳性细胞平均灰度值虽然高于含有TIMP-2-418C等位基因的牙龈组织,但无统计学意义;两种基因型的TIMP-2表达阳性细胞数量统计也无显著性差异。 结论:MMP-9和TIMP-2参与了侵袭性牙周炎牙龈组织的病变,但没有发现不同基因型AgP牙龈组织中MMP-9和TIMP-2表达水平有相应的变化。


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