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芪丹通脉片抑制缺血/再灌注心肌损伤作用及其信号通路机制

李军昌  
【摘要】: 急性心肌梗死后,通过药物溶栓、血管成形术等方法快速恢复心肌血流的再灌注策略对于挽救可用性心肌是必要的。然而,再灌注可加重缺血心肌损伤,表现为心肌细胞的丢失和功能恢复障碍。研究结果显示:缺血/再灌注心肌损伤(I/RI)的机制与防治方法是将来一段时间内需要解决的重要问题。凋亡是再灌注过程中导致心肌细胞丢失的重要病理形式。抑制凋亡能够减轻再灌注心肌损伤,促进心功能的恢复。缺血预处理和缺血后处理能够抑制心肌细胞凋亡,缩小心肌梗死面积,减少心律失常的发生。该类现象为防治缺血/再灌注心肌损伤策略的研究提供了切入点,而其共同的细胞内分子信号通路--再灌注损伤存活激酶(RISK)通路机制的关键分子可能成为防治I/RI策略的新的靶点。发现能够模拟上述两种现象的保护性药物受到广泛关注。探讨药物保护作用与RISK通路活化的相关性不仅能从分子水平认识药物的作用机制,而且能够为药物在临床准确有效的应用提供理论依据。 应用中药防治I/RI及其作用机制的研究是近年来中西结合心血管疾病研究领域的热点之一。实验研究发现:多种中药制剂具有保护心肌、抑制I/RI作用。其作用机制可能与抑制钙超载,抑制炎性反应,清除氧自由基等有关,但其信号通路机制尚不清楚。 芪丹通脉片由黄芪、丹参、当归、红花、桂枝等中药组成,具有益气活血,化瘀通脉的功效,能够保护缺血心肌。本研究在观察芪丹通脉片对大鼠I/RI模型心肌的保护作用基础上,探索该中药复方对I/RI中心肌细胞凋亡及其效应分子的影响,并对该中药复方对RISK通路的影响及其保护作用与RISK通路的相关性进行研究。 1芪丹通脉片对大鼠缺血/再灌注心肌损伤的影响雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、不同剂量芪丹通脉片组。分组干预7d后,通过结扎冠状动脉左降支40min后再灌注4h成功复制心肌I/RI模型。采用Evan’s Blue和TTC染色测定心肌梗死范围,并检测血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)和肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ),观察比较不同剂量的芪丹通脉片预处理对大鼠心肌I/RI的影响。结果发现:不同剂量(1.08g/kg,3.24g/kg)芪丹通脉片预处理,缺血/再灌注后心肌梗死面积分别为36.7±8.9%和28.8±8.4%,显著低于模型组(49.1±10.3%; P﹤0.05;P﹤0.01);缺血/再灌注4h后模型组大鼠血清中的CK和cTnI分别为12801.84±4102.70u/L和64.89±13.03ng/mL,与假手术组存在显著差异(1552.83±451.07u/L和1.40±0.64ng/mL,P﹤0.01;P﹤0.01);而不同剂量芪丹通脉片预处理组再灌注后血清中CK和cTnI的含量分别为10017.17±3345.46 u/L与47.23±12.76 ng/mL和6973.50±1778.40u/L与35.13±14.42ng/mL,与模型组比较存在显著差异( P﹤0.05;P﹤0.01)。以上结果表明:芪丹通脉片预处理能够诱导大鼠心肌对I/RI的耐受,有效地抑制缺血/再灌注所致大鼠心肌损伤。 2芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡及相关蛋白的影响应用上述实验中I/RI模型和分组方案,采用TUNEL法检测并计算I/RI心肌细胞凋亡指数;化学比色法测定心肌组织中的NOS活性;免疫组化检测心肌组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达;Western blot测定心肌组织中ERK1/2和p- ERK1/2的表达。结果发现:不同剂量芪丹通脉片(1.08g/kg,3.24g/kg)预处理可抑制I/RI中心肌细胞凋亡,其凋亡指数分别为14.3±3.8%和10.6±2.0%,与模型组(21.3±4.2%)比较均存在显著性差异( P﹤0.05;P﹤0.01)。 心肌组织中的iNOS活性显著高于假手术组(0.7484±0.1906U/mgprot vs 0.3454±0.1362 U/mgprot, P0.01),不同剂量芪丹通脉片预处理后可降低再灌注后iNOS的活性,以芪丹通脉片(3.24g/kg)组显著(0.4204±0.1351U/mgprot vs 0.7484±0.1906U/mgprot, P0.01);与模型组比较,不同剂量的芪丹通脉片预处理后均能够显著增加cNOS活性(0.5827±0.1680U/mgprot vs 0.3010±0.0617U/mgprot, P0.05;0.7618±0.2077U/mgprot vs 0.3010±0.0617 U/mgprot, P0.01)。手术组中NOS活性均较假手术组增高,但芪丹通脉片预处理组中NOS的活性与模型组无差异性差异(P0.05) 免疫组化研究结果发现:假手术组中Bcl-2和Bax均有少量表达,模型组较假手术组Bcl-2和Bax表达明显增加,平均灰度质明显下降(P0.05;P0.01)。模型组Bcl-2平均灰度质为165.17±9.21;不同剂量芪丹通脉片1.08,3.24g/kg预处理后缺血/再灌注心肌组织中Bcl-2的平均灰度值分别为147.82±19.51和118.65±16.31,平均灰度较模型组明显降低(P0.05;P0.01);模型组Bax平均灰度值为139.43±11.70,芪丹通脉片(1.08,3.24g/kg)预处理后Bax-2的平均灰度值分别为151.67±16.69和160.71±19.82,二者的灰度值与模型组比较有降低,但无显著性差异。 通过Western blot检测芪丹通脉片预处理对I/RI大鼠心肌ERK 1/2和磷酸化ERK1/2表达的影响,结果显示:芪丹通脉片组中ERK1/2的表达水平与假手术组、模型组中的表达水平无显著差异(P﹥0.05);芪丹通脉预处理组中pERK1/2的表达水平明显增加;其中3.24g/kg芪丹通脉预处理组与模型组比较,pERK1/2增加2.1倍(503.75±102.76 a.u vs 244.25±146.00 a.u , P0.01)。 以上研究结果表明:芪丹通脉片预处理能够减少缺血/再灌注心肌细胞的凋亡,这种抗凋亡的作用机制与改变心肌组织中不同NOS活性、调节细胞中抗凋亡蛋白的表达有关。芪丹通脉片对这些分子的调节效应与通过其增强磷酸化ERK1/2的表达水平、提高该蛋白激酶的活性可能存在相关性。 3芪丹通脉片抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡与PI3K/Akt相关性的研究 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、芪丹通脉片组和芪丹通脉片加PI3K/Akt抑制剂组。I/RI大鼠模型复制方法同前,用TUNEL法检测并计算再灌注后心肌细胞凋亡指数,Western blot测定心肌组织中PI3K/Akt蛋白激酶的表达和活性,观察再灌注前给与PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002对芪丹通脉片预处理组保护心肌、抑制再灌注损伤作用的影响。结果发现:芪丹通脉片预处理可使再灌注心肌细胞凋亡指数从模型组的20.3±4.5%减少至11.6±2.3%,二者存在显著差异(P﹤0.01)。再灌注前给于相应溶媒的假手术组,模型组和芪丹通脉片预处理组与再灌注前应用LY294002的芪丹通脉片预处理组中心肌组织中PI3K,Akt的表达水平无显著性差异,芪丹通脉片预处理组中心肌组织pAkt表达水平2.5倍,再灌注前给与LY294002的芪丹通脉片预处理组凋亡指数较芪丹通脉片预处理组增加,两者存在显著差异(17.0±5.5% vs 11.6±2.3%,P﹤0.05),与模型组凋亡指数(20.3±4.5%)比较没有显著性差异(P﹥0.05),同时抑制芪丹通脉片预处理诱导增加的p-Akt的表达水平。 以上结果表明:抑制p-Akt的表达水平阻断芪丹通脉片预处理的抗凋亡效果,PI3K/Akt信号活化是芪丹通脉片抑制缺血/再灌注所致的心肌细胞凋亡的重要信号途径。 综上所述,本研究结果证实了芪丹通脉片预处理对I/R大鼠心肌的保护作用。这种保护作用与芪丹通脉片调节心肌组织中不同NOS活性和增加抗凋亡蛋白的表达有关,而芪丹通脉片抗凋亡效应分子活化依赖于再灌注损伤磷酸化存活蛋白激酶表达水平的增加。因此,益气活血复方—芪丹通脉片的预处理保护作用通过活化RISK通路实现的。


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