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音猬因子方案定向诱导人骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究

胡慧敏  
【摘要】: 随着工业文明的快速发展,外伤性脊髓损伤患者的数量日渐增多,但脊髓损伤的治疗却一直是现代医学的难题,世界各地的医务工作者都在积极探索有效的治疗方法。近年来随着组织工程研究的兴起,使用干细胞组织工程技术治疗脊髓损伤受到了极大关注,为修复脊髓损伤提供了新的途径。其中种子细胞的选择与获取是神经组织工程研究的基础和热点。目前研究较多的种子细胞有神经干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质干细胞、雪旺细胞及嗅鞘细胞等。干细胞由于具有高度的自我更新与多向分化潜能,成为组织工程研究中重要的靶器官。骨髓基质干细胞是骨髓中的非生血干细胞,其起源于中胚层未分化的间充质细胞。由于具有取材便利,来源丰富,易于扩增分离,具有向多种中胚层和神经外胚层细胞分化的能力,且分化后回输自体时不存在免疫排斥及伦理学束缚等特点,成为最具潜力的种子细胞。 本实验应用密度梯度离心法分离培养骨髓基质干细胞,研究其生物学特性,采用全反式维甲酸、音猬因子和碱性成纤维生长因子8的不同组合方案诱导骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞,并进一步研究不同组合对细胞数量和活性的影响,寻找骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞的最佳方案,为神经组织工程提供充足、稳定的细胞来源。 实验第一部分应用密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞,培养并传代观察。研究并记录其生长特性和生物学特点;根据传代(P5)后细胞的形态学特征和成骨特性对分离、培养、传代后的骨髓基质干细胞综合鉴定。结果证实: 1.实验应用密度梯度离心法分离人骨髓基质干细胞,方法简便,成本低廉,原代培养成功率高达100%,所获取细胞48h贴壁率高、生长稳定、增殖速度快、形态较为均一。证实本实验方法可以稳定获取和扩增人骨髓基质干细胞。 2.根据细胞的形态学特征、表面特异性抗原和成骨特性对传代(P5)后细胞进行综合鉴定,发现所获取细胞外部形态上都成纺锤形或星形成纤维细胞状,形态较为均一;具有公认的骨髓基质干细胞相对特异性抗原;可以稳定诱导分化为骨细胞,证实所获取细胞为具有多向分化潜能的骨髓基质干细胞。 实验第二部分为采用全反式维甲酸、音猬因子和碱性成纤维生长因子8的不同组合方案诱导骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞,并进一步研究不同组合对细胞数量和活性的影响,寻找骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞的最佳方案。结果证实: 1.体外使用音猬因子(sonic hedgehog,SHH)可以诱导人骨髓基质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞(神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞),且在一定浓度范围内呈剂量依赖效应。C组组合(SHH 500ng/ml,FGF-8 100 ng/ml)为最佳诱导浓度,以较低浓度的诱导剂诱导产生的神经样细胞最多。且音猬因子可以促进细胞增殖,提高细胞成活率。 2.使用SHH联合RA共同模拟胚胎发育过程中的体内环境来诱导BMSCs定向分化为神经元细胞,这种组合方法可以进一步提高诱导效率,并降低RA对细胞的毒性,提高细胞成活率。 本实验成功、稳定的获取了人骨髓基质干细胞,并对其生物学特征进行了初步分析、鉴定。应用音猬因子及音猬因子与RA组合高效诱导人骨髓基质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞(神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞)为进一步研究骨髓基质干细胞分化成神经样细胞的分子机制,获得足量高活性的神经组织工程种子细胞提供了新的思路与方案。


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