胶原海绵为支架体外构建工程化心肌组织的实验研究

【摘要】： 研究背景:扩张型心肌病和冠心病(Coronary Artery Disease, CAD)如果没有得到及时有效的治疗,就会出现大量心肌细胞的损失,而成年心肌细胞是高度分化的终末细胞,受损后不能再生。心肌细胞数量的大量减少会导致严重心力衰竭和各种并发症。对于终末期心力衰竭患者,目前尚没有十分有效的治疗方法,心脏移植虽有一定疗效,但供体心脏来源不足,这种治疗手段的应用受到限制。鉴于此,研究人员不得不寻求新的治疗手段。心肌组织工程这一研究领域的出现,为解决这个难题提供了新的思路。 研究目的:以新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,采用胶原海绵为支架,研究于体外构建结构和功能基本等同于成年大鼠心肌的工程化心肌组织(Engineered Myocardial Tissue, EMT),为研究人类心肌组织工程奠定一定基础。 研究方法:先制备胶原海绵支架,用胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞,并经差速贴壁初步纯化,将新生大鼠原代心肌细胞接种于胶原海绵中,然后置入二氧化碳细胞培养箱中培养,通过肉眼及显微镜观察工程化心肌组织的自发收缩情况,用苏木精-伊红(Haematoxylin-eosin, HE)染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜检测工程化心肌组织的组织结构、细胞形态及特征性标记物。 研究结果:肉眼及显微镜观察可见,新生大鼠原代心肌细胞接种于胶原海绵上2 d后,细胞-胶原复合物局部出现点片状自发收缩,但各自发收缩区域相互之间无一致性,5 d后,整个细胞-胶原复合物出现同步化自发收缩,收缩强度随时间推移而加大,并于8 d后保持相对稳定,直至培养结束。HE染色显示,胶原海绵纤维已部分降解,细胞在工程化心肌组织内分布均匀,细胞之间相互连接呈网状,多数细胞呈纵向分布,核较大,呈长梭形,与成年大鼠心肌组织形态结构相似。免疫组织化学染色显示,多数细胞胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性,证明多数细胞具有分化的心肌细胞表型。透射电子显微镜可见,细胞内含有排列整齐的肌原纤维,沿细胞长轴分布,可清楚地看到Z线和肌小节,以及明显的细胞间连接。 研究结论:用胰蛋白酶消化法分离获得的新生大鼠原代心肌细胞,可用于体外构建工程化心肌组织的实验研究。以疏松多孔的胶原海绵为支架,新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,可于体外成功构建形态结构和生理功能均类似于成年大鼠心肌组织的工程化心肌组织。本实验为进一步的心肌组织工程研究做了初步的探索。