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钠钙交换体在缺血预处理产生的心肌保护中的作用及其机制研究

武峰  
【摘要】: 众所周知,缺血预处理可以保护心肌,减少缺血再灌注导致的心肌梗死面积,降低心律失常的发生率。然而其具体的机制仍未完全阐明。有研究发现,预处理期间短暂、可逆的胞内钙离子浓度升高与缺血预处理的保护作用密切相关。鉴于心肌缺血再灌注初期,通过激活NCX的反向转运模式使[Ca~(2+)]i升高,引起Ca~(2+)超载及由此导致细胞损伤,而缺血预处理的程序就是多个短暂的缺血再灌注过程,其病理生理条件相似,所以,我们设想NCX的反向转运模式可能参与缺血预处理期间[Ca~(2+)]i升高的调节,从而产生心肌保护作用。目前国内外尚无相关的研究报道。 缺血预处理的下游保护效应分子众多,但保护线粒体结构和功能的完整是缺血预处理保护作用机制中的关键,所以,探讨激活NCX的反向转运模式触发缺血预处理的保护作用的下游作用机制具有重要的意义。线粒体上的两种钾离子通道已经证明是缺血预处理保护作用的关键通道,因此探讨NCX引起[Ca~(2+)]i升高是否通过开放这两种离子通道从而中发挥了心肌保护作用,并且这两种离子通道在其作用机制中所扮演的角色,将为我们深入理解心肌缺血预处理的病理生理过程及其作用机制提供新的思路。 目的 1.明确胞外无钠法对大鼠心室肌细胞Na~+/Ca~(2+)交换体转运模式的影响; 2.观察E4031对NCX反向转运模式的影响,并明确其特异性程度; 3.在单心肌模型上观察缺血预处理期间,激活或阻断NCX的反向转运模式对预处理的心肌保护作用的影响; 4.在整体心脏模型上观察NCX的反向转运模式是否触发缺血预处理的保护作用。 5.观察Mito KATP和Mito KCa两种线粒体钾通道在激活NCX的药物预处理中的作用,并进一步完善IP的作用机制。 方法 1.以常规酶解法分离成年大鼠心肌细胞,选取形态、功能良好的心室肌细胞进行实验观察。应用胞外无钠法(NMDG)检测并通过Fura-2/AM荧光法记录[Ca~(2+)]i的变化。 2.预先给予Ryanodine和Thapsigargin孵育10min以阻断SR功能,分别给予Nifedipine(L-型钙通道阻断剂)和Ni2+、KB-R7943(NCX反向转运模式阻断剂),观察记录[Ca~(2+)]i的升高幅度变化。 3.给予E4031预先孵育后,观察NMDG导致的[Ca~(2+)]i的升高幅度变化,并观察给予KB-R7943对E4031引起的[Ca~(2+)]i变化的影响。 4.单心肌代谢抑制液孵育30min后,给予正常Tyrode液灌洗10min,通过代谢抑制法模拟缺血预处理的保护作用。此后再给予缺血液8min,正常Tyrode液灌洗10min制造缺血再灌注损伤。分别观察E4031预处理能否模拟MIP作用,KB-R7943能否阻断MIP和E4031的保护作用。 5.制备Langendorff离体心脏灌流模型,通过结扎/松开冠脉左前降支制造缺血/再灌注。通过2次5min的缺血再灌注过程模拟缺血预处理作用。以心肌梗死面积和缺血及再灌注初期室性心律失常量化做为评定标准。分别给予不同浓度和给药方式的E4031,观察其对缺血再灌注导致的心肌梗死的影响。进一步预先给予KB-R7943,观察是否阻断IP或E4031预处理的保护作用。 6.我们在给予E4031前,预先给予5-HD(Mito KATP的特异性阻断剂)或Paxilline(Mito KCa的特异性阻断剂)观察是否对E4031的保护作用产生影响,另外,在E4031给药结束后,给予5-HD或Paxilline,持续至再灌注后10min,观察E4031的保护作用是否会被阻断。同样,我们预先给予KB-R7943,以观察其对Diazoxid(eMito KATP的激动剂)或NS1619(Mito KCa的激动剂)保护作用的影响,以心肌梗死面积和缺血及再灌注初期室性心律失常量化做为评定标准。 结果 1.当灌流液换为NMDG液后1min,[Ca~(2+)]i即开始升高,而且随着灌流时间的延长,[Ca~(2+)]i升高幅度逐渐增大;将NMDG溶液中Ca~(2+)浓度由1.25升高至1.8mmol/L时,[Ca~(2+)]i升高幅度进一步增大,用正常Tyrode液冲洗后,[Ca~(2+)]i逐渐恢复,表明胞外无钠法可以准确反映[Ca~(2+)]i的变化。 2.应用L-型钙通道的选择性阻断剂Nifedipine后,NMDG溶液引起的[Ca~(2+)]i升高未见明显改变。而给予Ni2+或KB-R7943,NMDG溶液引起的[Ca~(2+)]i几乎被完全抑制。所以,NMDG溶液引起的[Ca~(2+)]i升高与NCX的反向转运模式激活密切相关。 3.预先给予含10μmol/L E4031的正常Tyrode液10min,可以看到,由NMDG溶液引起的[Ca~(2+)]i上升明显增加,并且使用15μmol/L KB-R7943可以阻断E4031引起的[Ca~(2+)]i变化。这结果表明,E4031通过激活或增强NCX的反向转运模式而引起[Ca~(2+)]i升高。 4.代谢预处理的方法可以模拟缺血预处理,明显改善缺血再灌注后心肌细胞的收缩功能。而在代谢预处理前给予KB-R7943,这种保护作用却明显被减弱。预先给予E4031也可以明显改善心肌细胞缺血再灌注后的收缩功能,而这种保护作用同样可以被KB-R7943明显阻断。 5.在离体灌流心脏上,缺血预处理可以明显减少I/R导致的心肌梗死面积,并且减少在缺血及再灌注初期10min内恶性心律失常的发生,而KB-R7943可以阻断这些保护作用。5μmol/L E4031不论是持续给予10min还是5min间断给予2次,均可以明显减少心肌梗死面积,但间断给予的方式产生的保护作用更加明显,并且KB-R7943也可以阻断其作用。但单独使用KB-R7943却对I/R的损伤没有任何影响。 6.预先给予5-HD/Paxilline或在E4031给药结束后,给予5-HD/Paxilline的两种给药方式均能明显阻断E4031的预处理保护作用,但是Diazoxide/NS1619的药物预处理保护作用却不受预先给予的KB-R7943的影响。 结论 1.应用Fura-2/AM荧光法记录[Ca~(2+)]i浓度变化,建立了通过胞外无钠法对心室肌细胞Na+/Ca~(2+)交换体转运模式的研究方法,并运用该方法明确了E4031可以特异性地激活或增加NCX反向转运模式。 2.通过在单心肌细胞和整体心脏的研究发现,NCX的反向转运模式参与了缺血预处理期间[Ca~(2+)]i升高的调节,从而触发了IP的心肌保护作用。激活NCX反向转运模式的药物预处理可以明显改善I/R导致的心肌收缩功能下降,减少心肌梗死面积并降低室性心律失常的发生。 3.在IP保护机制中,NCX应位于Mito KATP和Mito KCa通道的上游,并且这两种钾通道不但调节NCX反向转运模式激活的作用通路,而且还作为效应分子直接发挥了保护作用。


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