皮肤成纤维细胞修复原位冻融前交叉韧带的可行性相关实验研究

【摘要】： 前交叉韧带(Anterior Cruciate Ligament, ACL)是膝关节内重要稳定结构,对于维持膝关节稳定具有极其重要的作用,一方面其本身对防止胫骨前移起主要作用,并有部分纤维参与防止胫骨过度后移和内外旋转。另外一个方面,前交叉韧带通过与后交叉韧带和膝关节周围软组织的协同作用来维持膝关节的稳定。ACL损伤的发病率随着现代竞技体育及全民健身运动的发展而不断上升,损伤后由于缺乏自我愈合能力,而会进一步引起膝关节不稳并继发关节炎等,目前在临床主要需用移植物在关节镜下移植重建前交叉韧带。各种移植物都有其局限性,组织工程技术为目前的各种器官移植技术提供了较好的移植物选择前景,利用组织工程方法构建材料有望克服目前移植物的问题。种子细胞、生物材料和组织构建是组织工程的三个基本要素。种子细胞的选择成为韧带组织工程的研究课题之一。目前提出作为种子细胞的选择有皮肤成纤维细胞(SF)、内侧副韧带细胞(MCL)、前交叉韧带细胞(ACL),跟腱细胞(AT)。有体外实验表明在这四种细胞中,SF在增殖能力及胶原分泌功能上都优于MCL、ACL、AT细胞,是一种比较理想的ACL组织工程的种子细胞。本实验使用DiI和BrdU两种不同类型的标记物对皮肤成纤维细胞进行体内外的标记示踪,并将皮肤成纤维细胞复合纤维生物蛋白胶修复原位冻融的兔前交叉韧带和未修复的冻融韧带行对比,初步研究皮肤成纤维细胞作为种子细胞构建组织工程前交叉韧带的可行性。证明皮肤成纤维细胞是构建组织工程前交叉韧带较为理想的种子细胞,为组织工程化ACL的种子细胞提供一种种子细胞来源。 第一部分:原位冻融前交叉韧带损伤模型的建立 目的:为体内修复ACL建立一种较为可靠的ACL损伤模型。方法:首先使用液氮对兔ACL进行原位冻融,使用液氮冰冻1分钟,再在关节腔内注入室温生理盐水浸泡3分钟,重复上述步骤3次。结果:8周后取材,HE染色表明实施原位冻融的ACL内几乎无细胞核存在。天狼猩红染色显示原位冻融的ACLⅢ型胶原明显增加,ACL发生严重的退行性变。结论:通过以上手术方法可以为体内修复前交叉韧带损伤提供较为可靠的动物模型。 第二部分:皮肤成纤维细胞体外分离培养和生物学特性研究 目的:了解皮肤成纤维细胞的体外分离培养方法及其生物学特性,为采用SF进行韧带组织工程种子细胞的研究打下基础。方法:分别采用组织块法、酶消化法分离培养SF,对不同代次SF细胞进行相差显微镜观察、生长曲线测定。结果:酶消化法分离培养细胞贴壁快,传代五次后,细胞的生长速度减慢。结论:酶消化法分离培养SF细胞更适合于组织工程,SF细胞第一～第四代可作为构建组织工程化前交叉韧带的种子细胞。 第三部分:BrdU和CM-DiI标记示踪SF复合纤维蛋白胶修复ACL损伤的比较研究 目的:探索使用BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)和CM-DiI(1,1’-双十八烷-3,3,3’,3,-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐)标记SF的条件,比较两种标记方法效果及体内示踪的可行性。研究皮肤成纤维细胞在关节腔内的存活情况,以探索SF作为构建组织工程ACL种子细胞的可行性。方法:体外分离家兔自体SF,使用荧光染料CM-DiI对细胞进行标记,使用荧光倒置显微镜观察0,24, 48, 72 h细胞荧光强度及形态变化,MTT比色法测定标记前,后皮肤成纤维细胞的增殖状况。使用BrdU标记SF,并在标记后行细胞爬片的免疫组化染色,同样使用MTT比色法测定标记前,后皮肤成纤维细胞的增殖状况。分别标记后与纤维蛋白胶复合,植入原位冻融的ACL的关节腔内,并包裹在ACL周围。12周后取材,行HE染色及免疫组化染色。结果:DiI及BrdU标记SF的标记率良好,SF在使用DiI以及BrdU标记前后生长无区别。DiI标记后早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光,在72h无明显变化。体内实验结果,HE染色表现韧带周边有较多成纤维细胞聚集,周边胶原纤维走行较好,而内部发生严重的玻璃样改变。由于在荧光显微镜下,胶原纤维在荧光激发下发光,DiI显色与背景色较难区分,而免疫组化染色显示包裹在韧带周围的蛋白胶中有大量阳性染色团块存在。结论:使用DiI等一类荧光标记物在体内示踪方面劣势较BrdU明显,故BrdU在本实验研究中示踪效果优于DiI。皮肤成纤维细胞在关节腔内可以存活,可能是一种较为可行的种子细胞来源。 通过以上三部分研究,明确了SF体外分离培养方法,了解了其体外生物学特征,探索出较为可靠的体内标记示踪手段,皮肤成纤维细胞在冻融后的前交叉韧带可以存活,可能是作为构建组织工程前交叉韧带的较为理想的种子细胞选择。从而证明了SF是一种较为理想的前交叉韧带组织工程的种子细胞,为前交叉韧带组织工程的进一步研究打下基础。