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重组人Delta-like1蛋白的表达及其对Raji细胞作用的初步研究

何飞  
【摘要】: Notch信号途径广泛存在于多种生物体内,进化上高度保守,在胚胎发育、血细胞发育及肿瘤形成等多种病理生理过程中发挥重要作用。目前体外研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配体刺激。Notch配体表达系统分为真核表达系统和原核表达系统。真核表达绝大多数是哺乳动物细胞系,如CHO,COS7等,但由于哺乳动物细胞表达系统成本高、难操作、表达水平低,限制其广泛应用。而原核表达系统由于没有翻译后加工修饰系统,表达的真核细胞蛋白质多以包涵体形式表达,复性纯化方法复杂。而毕赤酵母表达系统兼有原核生物和真核生物的某些优点:有翻译后加工修饰系统,酵母能在简单廉价的培养基中快速高密度地繁殖,产量高,成本低,可进行工业化生产。因此在选择Notch配体的表达系统中我们首先选者毕赤酵母,其次是原核表达系统,但需要实现可溶性表达,以利于大规模应用。 Notch信号在造血系统发育中起着十分重要的作用:Notch信号使共同淋巴样祖细胞向T细胞方向分化,抑制向B细胞方向的分化;在外周脾脏B细胞发育中,Notch信号激活使其向边缘带B细胞方向分化。此外,Notch信号的失调与血液系统的许多肿瘤相关,Notch信号与T细胞的恶性转化密切相关,Notch在其中起着癌基因的作用。但Notch信号在B细胞肿瘤中的作用仍没有定论:Notch促进B细胞肿瘤的发生,还是抑制B细胞肿瘤的生长?Notch信号在B细胞肿瘤中起着癌基因作用,还是抑癌基因?不同研究组结论不一致。 我们主要进行了如下几方面的研究: 1、毕赤酵母表达重组人Delta-like1(hDll1)蛋白。PCR法扩增hDll1-127-225和hDll1-26-225片段,截取已有质粒pMikneo-Fc中Fc片段,构建酵母表达载体pPIC9K-hDll1-127-225-Fc,pPIC9K-hDll1-26-225-Fc和pPIC9K-Fc,经过组氨酸营养缺陷,G418抗生素双重筛选阳性转化子,甲醇诱导表达。 2、重组hDll1的原核表达。构建原核表达载体pGEX4T1-hDll1-127-225,pGEX4T1-hDll1-26-225,pET32a-hDll1-127-225和pET32a-hDll1-26-225,转化大肠杆菌BL21,IPTG、30℃低温诱导表达。 3、重组hDll1蛋白生物学功能的检测。通过报告基因实验及检测Notch下游分子Hes1的表达检测重组hDll1的生物学活性,并通过FACS及RT-PCR检测其对Raji细胞Notch信号的激活作用。 4、Notch信号对Raji细胞凋亡、增殖的作用;Notch通路与BCR通路共同对Raji细胞生长的影响及其可能的分子基础。重组hDll1激活Raji细胞Notch或GSI阻断其Notch通路,以AnnexinV-PI染色、CFSE染色,通过流式细胞仪FACS研究Raji细胞凋亡、增殖。Western Blot检测与Raji细胞增殖密切相关c-myc的变化。 结论:实现了hDll1-26-225-Fc和人IgG1 Fc片段的在毕赤酵母中的表达;30℃低温诱导实现重组hDll1(His-hDll1-127-225)的可溶性表达;通过报告基因实验,FACS及检测Notch下游分子Hes1的mRNA、蛋白表达验证了重组hDll1(His-hDll1-127-225)的生物学活性;Notch激活抑制Raji细胞凋亡,促进其增殖,Notch阻断剂GSI促进Raji细胞凋亡,抑制其增殖;Notch通路与BCR通路协同促进Raji细胞的增殖,这种协同作用能被GSI所阻断,c-myc可能在其中起关键作用。


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