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汉坦病毒感染体外培养乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的初步研究

贺帅  
【摘要】: 汉坦病毒(Hantavirus, HTVs)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Genus hantavirus),是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)的致病病毒。汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、多布拉戈一贝尔格莱德病毒(DOBV)和普马拉病毒(PUUV)分别引起重、中、轻程度不同的HFRS。 已证实HTVs在许多实验动物体内呈泛嗜性感染,且乳鼠脑对HTVs高度易感,易致致死性脑炎,这也是HTVs致死性的主要原因之一。HTVs侵入机体首先在血管内皮细胞增殖,后释放入血,研究证实病毒可经血脑屏障进入脑组织。星形胶质细胞终足包绕着毛细血管,是血脑屏障的重要组成成分。但目前对于HTVs感染星形胶质细胞尚鲜见报道,为此,我们首先建立了乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系,分别用HTNV 76-118和SEOV L99毒株感染细胞,为进一步研究HTVs的致病机制提供实验依据。 我们通过应用出生24 h内的Sprague–Dawley乳鼠,建立乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系;分别用HTNV 76-118株和SEOV L99株病毒感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞,于感染后1 d , 2 d , 3 d , 4 d , 5 d , 6 d和7 d收集细胞,免疫荧光染色、Western印迹和RT-PCR检测病毒感染细胞病毒NP和S基因片段的变化;用Hoechst33342染色、Annexin-V、Western印迹和RT-PCR检测病毒感染和星形胶质细胞间相互作用。结果发现:汉坦病毒感染星形胶质细胞1 d即可在细胞中检测到病毒抗原和少量病毒S片段RNA扩增产物,在病毒感染5 d、6 d和7 d,病毒NP表达量和病毒S片段RNA扩增产物量较病毒感染后1 d显著增多,随着感染时间的推移细胞阳性率逐渐增加(P﹤0.01)。且汉坦病毒感染后,未见凋亡细胞,Hsp70轻微增加趋势,GFAP呈增加趋势。本实验成功地建立了乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养体系,并证实其可作为HTNV和SEOV感染的靶细胞。随着感染时间的推移病毒感染细胞数和病毒量显著增加,但未见明显的细胞损伤效应。进一步证实HTVs感染后,Hsp70和GFAP反应性增高,且GFAP和病毒NP存在共定位,可能Hsp70和GFAP共同参与了HTVs发病过程。本研究中星形胶质细胞体外培养的建立,成功地病毒感染以及病毒感染后Hsp70和GFAP的变化为进一步研究病毒与靶细胞间相互作用及揭示HFRS发病机制提供实验基础。


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