HIV-1感染者CD8+T细胞中Toll样受体的表达及免疫功能研究

【摘要】： 【背景】 获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS），简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的致命性慢性传染病。研究显示CD8~+T细胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它所介导的CTLs反应是机体针对HIV-1感染最有力的效应武器，但其具体机制尚未完全阐明。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为联系固有免疫与适应性免疫系统的桥梁，可特异性的识别病原微生物，偶联信号转导途径，从而诱导特异性基因的表达和细胞因子/趋化因子的分泌，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。已有研究提示TLRs与HIV-1感染密切相关。但HIV-1感染者CD8~+T细胞与TLRs之间的关系尚未见报道。因此，本课题主要采用实时定量PCR（real-time PCR）法、流式细胞术及细胞内因子染色（intracellular cytokines staining,ICS）等技术分析了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8~+T细胞中TLR4、TLR5和TLR7的表达，以筛选出表达异常的TLR，并探讨其功能，从而为揭示HIV-1感染过程中TLR的作用、确定抗病毒药物的研制靶点及提供新的疫苗候选分子打下坚实的实验基础。 【目的】 1.筛选HIV-1感染者CD8~+T细胞中表达异常的TLR；2.研究TLR表达与CD4+T细胞计数、HIV-1病毒载量及HAART治疗的关系，探讨其在HIV-1感染过程中的意义；3.研究TLR配体对CD8~+T细胞的激活作用及CD8~+T细胞分泌细胞因子的情况，以了解HIV-1感染过程中TLR的功能及辅助因子在其中的作用。 【方法】 1.使用富集CD8~+T细胞抗体混合物从人外周血中分离CD8~+T细胞，采用实时定量PCR法筛选HIV-1感染者CD8~+T细胞中表达异常的TLRmRNA，TLRmRNA的相对表达量通过2- Ct法计算，随后采用流式细胞术在蛋白水 平验证TLR的表达差异；2.采用流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测HIV-1感染者CD4+T细胞计数及病毒载量，通过统计学方法分析表达异常的TLR与CD4+T细胞计数、病毒载量及HAART治疗的关系；3.采用密度梯度分离法从人外周血中分离PBMC，随后通过流式细胞术检测不同浓度的TLR7配体（0.5、1和5μg/ml）刺激6h后，纯化CD8~+T细胞和PBMC中CD8~+T细胞表面CD69的表达；4.应用细胞内细胞因子染色技术检测不同浓度的TLR7配体（0.5、1和5μg/ml）刺激6h及20h后，纯化CD8~+T细胞和PBMC中CD8~+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的情况。 【结果】 1.实时定量PCR法检测HIV-1感染者和正常人CD8~+T细胞中TLR4、TLR5和TLR7的表达，结果显示，HIV-1感染者CD8~+T细胞中均有TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表达，其中HIV-1感染者CD8~+T细胞中TLR7mRNA的表达显著升高（P0.05），而TLR4、TLR5mRNA的表达未见明显变化（P0.05）。为进一步证实TLR7的表达差异，采用流式细胞术检测了HIV-1感染者和正常人CD8~+T淋巴细胞中TLR7蛋白的表达，结果显示HIV-1感染者CD8~+T细胞中TLR7蛋白的表达亦显著升高（P0.05）。但HIV-1感染者CD8~+T细胞上TLR7的表达与CD4+T细胞计数、病毒载量均无明显相关性（P0.05）。根据CD4+T细胞计数（200cells/μl和200cells/μl）、病毒载量（105copies/ml和105copies/ml）及有无接受HAART治疗对HIV-1感染者进行分组，TLR7的表达亦无显著差异（P0.05）； 2.不同浓度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配体CL097刺激纯化CD8~+T细胞和PBMC 6h后，用流式细胞术检测CD8~+T细胞表面CD69的表达水平，结果显示HIV-1感染者和正常人纯化CD8~+T细胞表面CD69的表达均增高（P0.05），并且HIV-1感染者CD8~+T细胞表面CD69的表达显著高于其在正常人中的表达（P0.05）。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8~+T细胞表面CD69的表达也显著增高（P0.05），但与纯化的CD8~+T细胞表面CD69的表达无显著差异（P0.05）。并且CD69在CD8~+T细胞表面的表达呈浓度依赖性，CL097在浓度为0.5μg/ml时，CD8~+T细胞表面CD69的表达最高； 3.不同浓度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配体刺激纯化CD8~+T细胞6h后，采用细胞内细胞因子染色法检测CD8~+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的情况。结果显示HIV-1感染者和正常人CD8~+T细胞均未产生IL-2和IFN-γ。延长孵育时间至20小时，仍未见IL-2和IFN-γ的产生。不同浓度的TLR7配体（0.5、1和5μg/ml）刺激HIV-1感染者PBMC 6小时后，用细胞内细胞因子染色法检测CD8~+T细胞内IL-2和IFN-γ的分泌情况，同样未产生IL-2和IFN-γ。延长孵育时间至20小时，发现CD8~+T细胞可产生IFN-γ（P0.05），但未见IL-2的产生。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8~+T细胞IFN-γ的产生呈浓度依赖性，CL097在浓度为1μg/ml时，CD8~+T细胞产生的IFN-γ最多。 【结论】 1. CD8~+T细胞可表达TLR4、TLR5和TLR7。但HIV-1感染者CD8~+T细胞中TLR7的表达显著升高，提示HIV-1感染的发生、发展可能与TLR7有一定关系；2. TLR7配体可显著上调HIV-1感染者CD8~+T细胞表面CD69的表达，但与PBMC中CD8~+T细胞表面CD69的表达无显著差异，提示TLR7信号与HIV-1感染过程中的免疫激活有一定关系，但不依赖于辅助因子的参与；3. ICS检测发现TLR7配体虽不能刺激纯化CD8~+T细胞分泌细胞因子，但PBMC中的CD8~+T细胞可在其诱导下产生IFN-γ，提示TLR7信号可诱生HIV-1感染者CD8~+T细胞抗病毒分子的产生，但需要辅助因子的参与。这一研究可能为深入揭示HIV-1的免疫应答机制及其分子基础、选择新的药物治疗靶点和疫苗设计提供新思路。