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利用牙囊细胞和脂肪间充质干细胞构建组织工程牙周样结构的研究

武俊杰  
【摘要】: 牙周组织的再生从本质上讲就是牙周发育过程的再现,因此构建组织工程牙周样结构必须模拟牙周发育时的微环境。牙囊细胞是牙周组织的前体细胞,可以分化为成牙骨质细胞、成纤维细胞和成骨细胞。然而,目前对于牙囊细胞分化的机制还不清楚,对于牙囊细胞能否成为牙周组织工程的种子细胞还不明确。另外,脂肪间充质干细胞具有取材方便、细胞量大、多向分化能力强、免疫源性低等诸多优点,已经引起了学者们的广泛关注。那么,这种细胞能否在牙周发育微环境的诱导下参与牙周组织的再生?为了回答以上这些问题,本研究拟通过比较牙囊细胞与牙周膜细胞的异同,研究牙囊细胞分化的条件,来更深入地认识这种存在于牙周发育时期的细胞,探讨牙周发育的微环境,并将所获得的结果用来指导以牙囊细胞和脂肪间充质干细胞为种子细胞的工程化牙周组织的构建,为今后的临床应用奠定基础。 本课题的研究内容如下: 第一部分:牙囊细胞与牙周膜细胞的比较研究 目的:初步比较牙囊细胞和牙周膜细胞的异同。方法:复苏冻存的第四代人牙囊细胞和人牙周膜细胞,使用倒置显微镜进行细胞形态学观察,使用流式细胞术检测两种细胞的表面分子表达,将细胞与陶瓷骨(CBB)复合,移植入裸鼠皮下,4周、6周后取材,组织学观察。结果:两种细胞均为成纤维细胞样细胞,牙囊细胞胞体稍短,呈不规则的放射状排列,牙周膜细胞胞体则更为细长,呈整齐规则的有序排列。造血系细胞标志CD11b、CD34、CD45在两种细胞中呈阴性表达;间充质细胞标志CD29、CD44、CD90、CD105在两种细胞中均高表达;牙周膜细胞CD14表达高于牙囊细胞(6.23% VS. 2.72%),牙囊细胞STRO-1表达高于牙周膜细胞(20.99% VS. 14.1%),牙囊细胞MACAM/CD146表达明显高于牙周膜细胞(96.89% VS. 17.11%)。两种细胞与CBB复合后,在裸鼠皮下能够生成非常相似的组织结构。结论:牙囊细胞与牙周膜细胞具有高度的同源性,两者均来自外胚间充质细胞;牙囊细胞与牙周膜细胞均含有干细胞成份,牙囊细胞中含有的未分化的间充质干细胞更为丰富;牙囊细胞与牙周膜细胞的分化,需要一定的外部条件进行诱导。 第二部分:牙本质非胶原蛋白(dNCPs)对牙囊细胞的影响 目的:探讨牙本质基质成份是否影响牙囊细胞的增殖与分化。方法:分离、培养出生后6~7d SD仔鼠的牙囊细胞,实验组细胞用含有250μg/ml dNCPs的培养液进行诱导。之后开展一系列的体外实验,包括细胞形态学观察(倒置显微镜、扫描电镜及透射电镜观察)、细胞增殖检测(MTT、BrdU检测及细胞周期分析)、细胞矿化能力检测(ALP活性检测、von Kossa染色)、免疫细胞化学分析、RT-PCR检测;建立牙囊细胞体内分化模型,进行大鼠肾被膜下移植。结果:经dNCPs诱导后,牙囊细胞的形态发生明显改变,增殖受到抑制,矿化能力增强,表达矿化相关的蛋白和基因,呈现成牙骨质细胞特征,在牙本质载体中生成大量的牙骨质样结构。结论:dNCPs能够促进牙囊细胞向成牙骨质细胞分化,这一结论补充了牙骨质生成的经典理论。 第三部分:牙胚根部细胞条件培养液(ATGC-CM)对牙囊细胞的影响 目的:探讨牙胚根部细胞条件培养液对牙囊细胞增殖与分化的影响。方法:分离培养出生后6~7d SD仔鼠的牙囊细胞,实验组细胞用ATGC-CM进行诱导。体外实验包括MTT检测、流式细胞周期分析、ALP活性检测、免疫细胞化学分析;体内移植实验利用牙囊细胞体内分化模型,进行大鼠肾被膜下移植;移植物进行免疫组化染色。结果:经ATGC-CM诱导后,细胞增殖受到抑制,ALP活性增强,表达矿化组织形成细胞和牙周膜成纤维细胞的相关蛋白,在牙本质载体中生成大量的骨样组织和纤维组织,免疫组化染色确定该矿化组织为骨组织。结论:牙胚根部细胞条件培养液中含有多种与牙根牙周组织发育相关的生物活性因子;牙胚根部细胞条件培养液可以诱导牙囊细胞向成骨细胞、成纤维细胞分化。 第四部分:利用牙囊细胞和脂肪间充质干细胞体内异位构建牙周样结构的研究 目的:探讨利用牙囊细胞和脂肪间充质干细胞体内异位构建牙周样结构的可行性。方法:用dNCPs和ATGC-CM共同诱导大鼠牙囊细胞,之后将细胞与经处理的牙本质块复合,由新型PLGA纤维膜包裹,移植入大鼠肾被膜下,术后4周、8周取材,组织学观察;分离、培养并鉴定大鼠脂肪间充质干细胞;用dNCPs和ATGC-CM共同诱导脂肪间充质干细胞,之后采取三种复合方式:①将脂肪间充质干细胞与CBB复合;②与牙本质块复合,之后用PLGA膜包裹;③与脱矿骨管腔内的牙本质块复合;移植入大鼠肾被膜下,术后4周、8周取材,进行组织学观察。结果:经诱导后,牙囊细胞在牙本质表面形成牙骨质样结构,有纤维组织垂直埋入其中,呈现牙骨质/牙周膜样结构;分离、培养的大鼠脂肪间充质干细胞具有干细胞的特性;经诱导后,脂肪间充质干细胞可以在CBB、牙本质块表面形成牙骨质/牙周膜样结构,牙本质块组更为明显,在靠近脱矿骨一侧生成骨样组织。结论:牙囊细胞在一定的诱导条件下能够形成牙骨质/牙周膜样结构;通过异位组织工程的方法进行体内构建牙周样结构是可行的;脂肪间充质干细胞是间充质来源细胞,具有多向分化能力;脂肪间充质干细胞在一定的诱导条件下,可以在体内异位环境中形成牙骨质/牙周膜样结构,有望成为牙周组织工程领域的一类重要的种子细胞。


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