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一个新的ERM家族分子的鉴定及对细胞形态的影响

徐清  
【摘要】: 目的制备抗hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)多克隆抗体,鉴定hErmin分子在正常成人脑组织中的表达,以及研究hErmin对细胞形态的影响,为深入研究hErmin分子的功能奠定基础。方法PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其抗血清,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-blot检测抗体纯化的效果;用纯化的抗hErmin160多克隆抗体为一抗,分别用Western-blot法和免疫组织化学法对hErmin分子在正常成人脑组织中的表达进行鉴定;通过转染,在体外培养的细胞中过表达hErmin分子,用细胞免疫荧光法观察hErmin分子对细胞形态的影响。结果测序证实获得hErmin氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占上清中菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%,Western-blot鉴定所表达的融合蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体Western-blot反应均为阳性;纯化所得的抗体能与真核表达系统表达的hErmin分子结合,并且hErmin分子在正常成人脑组织中的表达得到确认;转染过表达hErmin分子的细胞长出了更多突起。结论:利用大肠杆菌原核表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hErmin160多克隆抗体;我们鉴定了一个新的ERM家族成员hErmin分子在人脑中的表达;并且在体外培养的细胞中,此分子的表达可以促进细胞长出更多突起。


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