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CD226分子在小鼠脑内的表达及其功能的初步研究

张涛  
【摘要】: CD226分子是一种分子量为~65kDa的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,是一种细胞粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)。自1985发现该分子以来,人们对CD226分子的基因、结构、表达、分布及功能做了大量研究,并且证实该分子广泛参与机体免疫系统多种重要的生物学功能,包括T细胞的增殖与分化,血小板的活化与凝集,NK细胞的杀伤等。然而,有关机体免疫系统以外CD226分子表达和功能的研究却未见报道。近些年来,越来越多的研究表明许多本来表达于免疫系统的CAM也表达和分布于神经系统,并且与中枢神经系统(central nervous system,CNS)内突触发生和突触结构可塑性调节等功能密切相关。 CAM是一种广泛分布于机体内的跨膜糖蛋白,在细胞间的识别与粘附过程中发挥重要作用,进而广泛参与机体多种重要的生理功能,包括胚胎发育、细胞信号转导、炎症及肿瘤转移等等。近些年来,包括neurexin、neuroligin、cadherin、Nectin、NCAM(neural cell adhesion molecule,神经细胞粘附分子)以及SynCAM在内的一些CAM家族成员,已经被证实表达和分布于机体神经系统内,并且在突触发生过程中的靶向识别、突触分化、以及学习记忆过程中突触的可塑性调节方面发挥了重要作用。 迄今为止,有关CD226分子在神经系统表达和分布的研究尚未见报道,但是越来越多的证据显示CD226分子可能分布于CNS内并且参与重要的生理功能。首先,CD226分子与其他分布于神经系统内的CAM分子结构类似,表现为这些分子的胞膜外区都有若干个免疫球蛋白超家族V样结构域,胞浆区末端均有一段能够与细胞骨架特定结构结合的保守序列。其次,最近的研究表明Nectin家族成员Nectin-2/CD112及Nectin样分子(Nectin-like molecule,Necl)家族成员Necl-5/CD155是CD226的配体,而Nectin及Necl家族中的不少分子已被证实表达于神经系统,并且分别分布于特定脑区的突触前膜和/或突触后膜。 本研究综合运用分子生物学、免疫学及形态学等多种研究方法,在国际上首次证实了CD226分子在小鼠神经系统内的表达和分布以及该分子在小鼠生后发育过程中表达和分布的变化;证实了在体外培养条件下,外源性CD226及CD155分子能够显著促进海马神经元的生长发育,并且在神经突起生长过程中发挥了靶向识别作用;证实了缺氧不同时间后海马神经元内CD226分子表达水平逐渐下调,且缺血性脑血管病患者及脑肿瘤患者血清中可溶型CD226分子水平发生上调。具体研究内容如下: 1.首先运用RT-PCR及Western blotting方法,从mRNA和蛋白水平证实了CD226分子主要表达于小鼠脑内的海马和小脑组织;免疫组织化学结果显示,在成年小鼠脑内CD226分子主要分布于海马CA3区透明带及邻近的齿状回门区,小脑皮质颗粒细胞间隙以及Purkinje细胞胞体,荧光双标结果显示CD226分子与突触标志物Synaptophysin、Syntaxin以及PSD-95广泛共存,而与神经元标志物NeuN以及星形胶质细胞标志物GFAP(glial fibrillary acidic protein,神经胶质酸性蛋白)没有共存,免疫电镜结果进一步证实CD226分子可能分布于上述脑区的突触前膜和突触后膜;而在小鼠生后发育早期,P12以前CD226分子并不表达于其成年时分布脑区,而是一过性表达于与上述脑区具有密切纤维联系的邻近或者远离的神经核团内。 2.成功对新鲜分离的胎鼠海马神经元细胞进行体外培养,并且运用免疫荧光染色方法观察了体外培养不同时间海马神经元的细胞形态以及CD226分子的表达情况;运用脂质体转染的方法,成功地将mCD22(6murine CD226,小鼠CD226)-GFP或mCD155(murine CD155,小鼠CD155)-RFP两种质粒转染入Hela细胞,并将其与新鲜分离的胎鼠海马神经元细胞进行共培养,进而证实在体外培养条件下,外源性CD226及CD155分子能够显著促进海马神经元的生长发育,主要表现为神经突起数量增多和长度增加,而且外源性CD226及CD155分子还能促进神经突起向表达它们的Hela细胞进行生长并且发生纤维联系,发挥了靶向识别作用。 3.成功建立新鲜分离的胎鼠海马神经元细胞缺氧模型,运用免疫荧光染色方法观察了细胞缺氧不同时间后神经元形态的改变及CD226分子表达的变化;运用Western blotting方法证实了随着细胞缺氧时间的延长,神经元内CD226分子的表达水平逐渐下调,缺氧24h后几乎完全消失。运用改良的夹心酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)证实,缺血性脑血管病患者及脑肿瘤患者血清中可溶型CD226分子的水平显著高于正常人。 总而言之,本次实验在国际上首次证实了CD226分子表达和分布于神经系统,并且对CD226分子在神经元生长发育过程中发挥的作用、以及疾病时CD226分子表达水平的变化进行了初步探讨,为进一步研究CD226分子在神经系统内可能参与的生理功能及其分子机制奠定了基础。


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