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6-羟多巴胺诱导的去交感神经支配对大鼠骨代谢的影响

敖建华  
【摘要】: 骨结构在人的一生中不停的改建并接受各种系统性和局部性因子的调节。最近的组织化学和药理学研究发现神经系统参与骨代谢的调控,其调控由成骨细胞和破骨细胞来媒介的,同时发现人成骨细胞和破骨细胞胞膜上有多种肾上腺素受体和神经肽受体,表明外周交感神经和感觉神经元通过与成骨细胞和破骨细胞的突触接触来动态的局部调控骨的代谢。目前大量的离体和活体实验已经证实交感神经系统参与骨代谢的调控,交感神经系统可以通过对成骨细胞及破骨细胞的调节而间接影响到骨组织代谢。近期的研究表明交感神经及外周感觉神经轴突向成骨细胞及破骨细胞延伸是受到局部骨代谢的动态神经调节。骨膜受到有髓鞘与无髓鞘的感觉神经纤维支配。这两种神经纤维均能释放出降钙素基因相关肽(CGRP)与P物质(SP)。而降钙素基因相关肽(CGRP)与P物质(SP)已经被证实直接和/或间接调节成骨细胞与破骨细胞[1-7]。而交感神经对骨代谢影响的机制尚未完全阐明。 6-羟多巴胺是一种常被用来选择性地杀死多巴胺和去甲肾上腺素神经元的一种神经毒素。作为一种神经毒剂,6-羟多巴胺可以选择性破坏交感神经末梢。同时,在外周应用时不经过血脑屏障,并破坏外周交感神经轴索纤维,是目前一种公认的交感神经化学切除剂[8-9]。 在本研究中,我们采用了三种不同剂量的6-羟多巴胺来选择性的破坏成年大鼠的交感神经纤维,通过μCT扫描观察骨量和结构的变化,采用RT-PCR技术检测mRNA表达水平,采用生物材料力学指标检测骨强度的变化,血浆生化学ELISA分析骨细胞代谢活性标记物含量的变化以及组织学检查来观6-羟多巴胺诱导的交感神经切除对骨代谢的影响。 材料方法 32只8周龄雄性Wistar大鼠被随机分成4组,对照组和三种不同剂量6 -羟多巴胺治疗组(100mg/kg,200mg/kg和300mg/kg),每组8只,6 -羟多巴胺和溶剂(对照组)连续5天在大鼠腹腔内注射,4周后所有动物经腹动脉放血处死,处死前13天和3天前分别腹腔注射四环素和钙黄素。胫骨、股骨、第6腰椎和血浆标本取材。 右侧胫骨的近中骨骺端行μCT扫描,在图形工作站上去除皮质骨的影像,进行海绵状骨三维结构重建,计算出相对海绵状骨骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。右侧胫骨的近中骨骺端标本μCT扫描后脱水,树脂包埋,制作不脱钙组织切片,在荧光显微镜下观察,测量四环素和钙黄素荧光带的间距,计算骨矿化沉积率[mineral appositional rate,MAR(μm /d)]。 左侧股骨和第6腰椎椎体分别进行三点弯曲和压缩实验,计算骨的生物材料力学参数。左侧股骨和第6腰椎取材后-20℃生理盐水保存,解冻后,分离第6腰椎椎体并磨除两端骨质形成柱状体结构,使用电脑控制的材料力学分析仪进行第6腰椎椎体压缩实验,椎体置于载物台上,连接传感器的压缩杆以1mm/分的速度压迫椎体直至变形;股骨至于间距20mm的两金属杆顶端,进行三点弯曲实验,压缩杆以10mm/分压迫股骨中段部直至折断。计算机自动记录压力-挠度曲线,得出骨的四个生物材料力学参数:强度、延展性、韧性和弹性模量。 从右侧股骨近中骨骺端提取mRNA,并使用RT-PCR技术检测细胞核因子κB受体活化因子配基(Ligand of receptor activator of NFκB,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的表达,进行定量分析。RANKL、OPG是成骨细胞正常的分泌分子,RANKL主要作用是刺激破骨细胞的分化,增强成熟破骨细胞的活性并且抑制其凋亡,OPG作为RANKL的诱骗受体竞争性抑制RANKL的作用,从而抑制破骨细胞的形成和功能。RANKL/OPG的相对水平是决定破骨细胞形成及其活性大小的关键因素。 应用ELISA检测血浆中的成骨细胞活性标记物骨钙素(Osteocalcin)和破骨细胞活性标记物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的含量。大鼠腹动脉血置于干燥管离心取血浆保存于-80℃冰箱,解冻后,按照大鼠骨钙素(Rat Osteocalcin)ELISA试剂盒和大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b(Rat TRAP 5b) ELISA试剂盒说明书实验步骤检测血浆中骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量。骨钙素是由成骨细胞分泌的一种活性多肽,在调节骨钙代谢中起着重要作用,是研究骨代谢的一项新的生化标志物。TRAP是破骨细胞骨吸收中表达并被释放进入血循环,TRAP被认为是有效测定骨吸收速率的潜在标记物。 左侧胫骨的近中骨骺端标本甲醛固定48h,20% EDTA脱钙三周,脱水,石蜡包埋,制作石蜡切片,行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,光镜观察,组织形态测定法来测定破骨细胞数目(Oc.N/BS)和骨吸收表面积(Oc.S/BS)。 结果 μCT扫描结果显示大剂量6-羟多巴胺(300mg/kg)组胫骨近心骨骺端海绵骨体积分数(BV/TV)明显增加,骨小梁分离度(Tb.Sp)明显缩小,BV/TV较对照组增加18.9%(P0.05),Tb.Sp减少13% (P0.05)。 第6腰椎椎体压缩实验显示大剂量6-羟多巴胺(300mg/kg)组骨生物材料力学参数如强度、延展性和韧性分别较对照组增加19.7%(P0.01), 28.7%(P0.05)和40.4%(P0.05)。股骨三点弯曲实验结果显示各项生物材料力学参数在实验组和对照组之间无显著差异(P0.05)。 RT-PCR检测显示各剂量组与对照组比较骨保护素(OPG)的表达无显著差异(P0.05),而大剂量6-羟多巴胺(300mg/kg)组中细胞核因子κB受体活化因子配基(RANKL)的表达较对照组显著减少27%(P0.05)。 血浆中骨钙素(Osteocalcin)的含量各剂量组与对照组之间无显著差异(P0.05),在大剂量6-羟多巴胺(300mg/kg)组中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的含量与对照组比较显著减少50.3%(P0.05)。 组织形态测定法测定中等剂量组(200mg/kg)和大剂量6-羟多巴胺(300mg/kg)组破骨细胞数目(Oc.N/BS)较对照组分别显著减少45%(P0.01)和70%(P0.01);骨吸收表面积(Oc.S/BS)分别显著减少25%(P0.01)和37%(P0.01)。 结论 本实验结果显示6-羟多巴胺诱导的交感神经切除可以抑制骨吸收,但对骨生成没有影响,证实交感神经支配参与骨代谢的调节。6-羟多巴胺抑制骨吸收的作用主要发生在大剂量组,小剂量组对骨的代谢无影响,中等剂量组破骨细胞数量和骨吸收表面积显著减少但骨量没有显著变化。6-羟多巴胺抑制骨吸收可能是通过调节破骨细胞数量及活性完成的,对成骨细胞没有影响。


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