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生存素在胰岛素抑制缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡中的作用

司瑞  
【摘要】:研究背景 缺血性心脏病,严重威胁人类健康。及时有效的恢复缺血心肌的血液供应,是挽救濒死心肌、减少患者死亡率的关键。但恢复血液灌注的同时,可能会导致心肌损伤,不仅影响治疗效果及愈后,严重者甚至导致死亡。再灌注损伤的机制复杂,而心肌细胞凋亡是其重要的机制之一。我们前期研究发现,胰岛素是极化液的主要作用成份,可通过激活“生存信号”通路,即磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路,抑制缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡,保护心脏功能,而进一步的心肌eNOS的激活及NO的产生,是胰岛素抑制心肌细胞凋亡的主要机制。然而,胰岛素诱导的凋亡抑制的机制仍未完全阐明。生存素蛋白,是凋亡抑制蛋白家族的特殊成员,具有调控细胞分裂,抑制细胞凋亡的双重作用。研究多集中在肿瘤的诊断和治疗。例如,研究发现胰岛素生长因子-1可通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ,mTOR)分子,上调肿瘤细胞的生存素表达,促进肿瘤细胞增殖。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素可通过抑制mTOR,减少生存素表达,促进肿瘤细胞凋亡。近期研究表明,生存素在心血管系统疾病中也扮演着重要的角色,研究发现,在血管内皮发生损伤时,内皮细胞可通过表达生存素,抑制内皮细胞凋亡,保护血管内皮稳态等。但是生存素是否在缺血心肌组织内表达,以及胰岛素对缺血/再灌注心肌中生存素表达的影响及意义,仍不明确。 实验目的 本研究的目的是:1)观察胰岛素作用时,大鼠缺血/再灌注心肌SVV的表达;2)探讨SVV表达变化与胰岛素心脏保护作用的关系;3)研究胰岛素对SVV的表达调控机制。 实验方法 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,构建离体心脏缺血/再灌注模型,缺血30min,再灌注2h,3h和4h,Western blot方法检测大鼠心肌SVV的表达。进一步于再灌注前5min给于胰岛素、胰岛素+PI3K特异性抑制剂LY294002或胰岛素+mTOR特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)处理。观察信号蛋白分子Akt、mTOR、p70S6k磷酸化水平及survivin(SVV)表达的改变。期间进行血流动力学监测,再灌注结束后,检测心肌梗死面积及细胞凋亡变化。细胞水平,分离培养大鼠乳鼠心肌细胞,感染携带survivin目的基因的腺病毒过表达SVV或转染针对survivin的siRNA,抑制SVV表达。在细胞水平建立模拟缺血/再灌注模型,Western blot及qRT-PCR方法检测心肌细胞生存素表达,TUNEL方法检测模拟缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡的改变。 实验结果: 缺血/再灌注可刺激大鼠心肌少量表达SVV,可能是一种心脏自我保护机制。胰岛素再灌注则显著增加SVV水平,呈时间依赖性,在3h达到高峰。再灌注时使用胰岛素,不仅显著减少大鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡,心脏收缩功能也得到的改善,并伴有下游分子PI3K、mTOR及p70S6k的磷酸化水平的增加以及SVV的上调。此作用可被PI3K抑制剂LY294002显著抑制。而mTOR特异性抑制剂雷帕霉素,对胰岛素激活Akt无显著影响,但可明显抑制mTOR及下游分子p70S6k的磷酸化以及SVV的表达。同时,伴有心肌梗死面积及细胞凋亡增加,心功能下降,胰岛素的心脏保护作用被显著抑制。提示PI3K/Akt/mTOR通路的激活参与胰岛素对SVV表达的调节,同时是胰岛素心肌保护中的作用的重要机制。细胞水平进一步证实SVV表达与胰岛素抑制心肌细胞凋亡的相关性。腺病毒转染心肌细胞过表达SVV,可抑制模拟的缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。而针对SVV的siRNA转染心肌细胞,抑制细胞SVV表达时,不仅模拟缺血/再灌注诱导的细胞凋亡增加,同时减弱了胰岛素的凋亡抑制作用。 结论 上述结果表明,缺血/再灌注可刺激大鼠心肌细胞SVV少量表达,而胰岛素再灌注可显著增加心肌SVV表达,PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活参与胰岛素对生存素的表达调控,上调的SVV是胰岛素抑制缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡的重要作用机制。


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