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RvE_1对肝缺血再灌注损伤中Kupffer细胞活化调控作用的研究

高小鹏  
【摘要】:背景 肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)在肝脏外科领域十分常见,处理严重的肝外伤、施行广泛的肝叶切除、肝移植以及出血性休克、感染等均涉及到HIRI。它可导致术后肝损伤和肝功能衰竭甚至全身多脏器功能衰竭,是影响疾病预后主要因素之一。因此探讨其发病机制具有非常重要的意义。其发生机理非常复杂,确切机制目前尚不完全清楚,目前的研究表明肝缺血再灌注损伤是涉及多种细胞、分子之间相互作用的复杂的病理生理过程,其中Kupffer细胞作为体内最多的定居巨噬细胞群发挥了关键的作用。肝脏发生缺血时,由于无氧代谢造成的ATP生成减少,细胞内乳酸堆积以及线粒体氧化磷酸化低下所致的酸性环境和细胞内Ca2+增加而使Kupffer细胞处于“预”激活状态,当血流重新开放后门静脉中的内毒素在数分钟内就可使处于“预”激活状态的Kupffer细胞激活,活化的Kupffer细胞可以释放大量氧自由基和多种活性因子,这些炎性因子以单个的形式,也可以通过彼此间网络状协同作用,形成瀑布样效应,加重了肝损伤。因此,探讨Kupffer细胞在HIRI的病理生理过程的作用,才有可能更有效地防治HIRI。 RvE1(Resolvin E1,RvE1)是不饱和脂肪酸EPA的一种代谢产物。近年研究表明RvE1具有抗炎和前消退炎症的特性,它可以阻止炎症细胞跨上皮和跨内皮迁移;促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞;下调树突状细胞白介素-12的分泌;上调T细胞CCR5的表达;调节白细胞粘附分子的表达,减少白细胞滚动;选择性的阻断腺苷和血栓素受体激动剂U46619诱导的血小板聚集。它对许多炎症性疾病有良好的预防和治疗效果,鉴于炎症是HIRI的关键环节且RvE1对肝缺血再灌注损伤及Kupffer细胞的活化的调控作用目前国内外尚未见报道。为此,我们建立大鼠肝缺血再灌注动物模型,分离并原代培养大鼠Kupffer细胞,检测Kupffer细胞中趋化因子Chemerin和MIP-2的表达及其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β的变化,探讨RvE1对肝缺血再灌注损伤影响及对肝缺血再灌注损伤时Kupffer细胞活化的调控作用,拟对临床中应用RvE1防治肝脏缺血-再灌注损伤提供实验性理论依据。 目的 通过体内和体外实验,研究RvE1对大鼠肝缺血/再灌注损伤后Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2基因的表达和其分泌TNF-α、IL-1β水平的变化的影响,探讨其在肝缺血/再灌注损伤中的意义。 方法 (1)采用两步消化、梯度离心、选择性贴壁的方法提取大鼠Kupffer细胞,并通过荧光显微镜观察、台盼蓝染色、溶菌酶免疫组化染色、印度墨汁示踪分离等方法进行鉴定,以建立稳定的分离、培养大鼠Kupffer细胞的技术路线。 (2)构建大鼠肝热缺血再灌注损伤模型,采用ELISA法检测再灌注损伤后0、1、6、12、24小时大鼠Kupffer细胞原代培养上清液中TNF-α、IL-1β浓度的变化,并采用RT-PCR、免疫组化染色技术对Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白的表达进行检测,研究其在肝缺血/再灌注损伤中的意义。 (3).72只雄性SD大鼠分为对照组、缺血再灌注损伤和RvE1治疗组,观察RvE1对大鼠肝缺血再灌注损伤1、6、12、和24小时后血清中ALT和AST变化及其对肝脏病理改变的影响,观察RvE1对Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白及其分泌TNF-α、IL-1β的变化,探讨RvE1对肝缺血再灌注损伤的保护作用机制。 (4)通过体外实验,观察RvE1体外对大鼠肝缺血再灌注损伤活化的Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2的mRNA及其分泌TNF-α、IL-1β的影响,探讨RvE1抑制Kupffer细胞活化的机理。 结果 (1).本实验所分离Kupffer细胞获得率为7.34±1.54×106cells /鼠肝,纯度为87.18±3.18%,活性为94.3%±2.6%,吞噬印度墨汁实验提示所分离的Kupffer细胞有很好的吞噬功能。所获得的Kupffer细胞可以达到实验要求。 (2)在再灌注损伤后的极早期,Kupffer细胞即分泌大量TNF-α和IL-1β,二者在再灌注1h后几乎达到高峰,至实验观察最后时间点,再灌注24h时,其分泌TNF-α和IL-1β的水平依然高于对照组。 (3) RvE1组血清中ALT和AST明显低于缺血/再灌注组(P<0.05),Kupffer细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β水平及Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2蛋白和mRNA表达较假手术组明显升高(P<0.05),术前应用RvE1可以明显降低这些炎性因子的表达(P<0.05)。 (4)经缺血后再灌注6小时活化的Kupffer细胞可分泌大量TNF-α和IL-1β,在Kupffer细胞的培养液中分别加入不同浓度的RvE1,KC分泌的TNF-α和IL-1β水平均有不同程度下降(P<0.05)。且随着培养液中RvE1浓度的增加,抑制程度愈加明显。缺血再灌注6小时活化的Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2 mRNA含量高于假手术组(P<0.05),在活化的Kupffer细胞的原代培养液中分别加入不同浓度的RvE1,KC中Chemerin和MIP-2 mRNA水平明显下降(P<0.05),具有剂量依从关系,RvE1高剂量组的Chemerin和MIP-2 mRNA水平仍然高于假手术组(P<0.05),有统计学意义。 结论 (1)采用两步消化、梯度离心、选择性贴壁的提取方法所提取的Kupffer细胞可保持良好的生物学性状,其数量、活力和纯度均能达到实验要求。 (2)大鼠部分肝热缺血再灌注模型具有再灌注损伤病理过程典型的特点,可较好的模拟临床肝脏反应肝缺血再灌注损伤的病理过程。肝缺血再灌注过程中Kupffer细胞分泌的大量TNF-α和IL-1β对HIRI的发生、发展起关键作用,而其产生的Chemerin和MIP-2也可能是介导HIRI发生的重要因素。 (3) RvE1预处理可降低HIRI大鼠血清中ALT和AST水平,且可部分抑制HIRI大鼠Kupffer细胞活化,抑制Kupffer细胞中TNF-α和IL-1β的分泌,并可下调Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白的表达。RvE1对大鼠肝缺血再灌注损伤具有较好的治疗作用。 (4) RvE1在体外可以减少肝脏缺血再灌注活化的Kupffer细胞分泌过度的TNF-α和IL-1β,并可降低Kupffer细胞中Chemerin和MIP-2 mRNA的表达,其效应具有剂量依从关系。提示RvE1在体外对肝脏缺血再灌注活化的Kupffer细胞具有一定的抑制作用,RvE1可能通过直接抑制Kupffer细胞的活化及其分泌炎性因子的途径减轻肝脏缺血再灌注损伤。


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