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基于骨髓基质干细胞构建无外支架组织工程骨的实验研究

马东洋  
【摘要】: 实验一兔骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定 目的:探讨自然贴壁筛选法分离、培养兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并对其初步鉴定。方法:全骨髓贴壁筛选法培养,观察BMSC的生长特点、形态学特征,并检验在不同的条件培养基诱导下向骨、软骨、脂肪分化的潜能。结果:贴壁细胞呈纤维状集落生长,增殖能力强,可向骨、软骨、脂肪等间充质细胞分化。结论:自然贴壁筛选法可以分离培养兔BMSCs。 实验二BMSC膜片的构建及其成骨分化的实验研究 目的:探索一种在普通培养皿上构建细胞膜片的简单方法并研究BMSC膜片向成骨细胞分化的潜能。方法:将兔BMSC高密度接种于普通培养皿,在成骨诱导条件下连续培养2周,沿培养皿底外周用细胞刮小心刮擦,获得细胞膜片。通过组织学、组织化学、电镜、碱性磷酸酶定量检测、骨相关蛋白RT-PCR等方法检测细胞膜片的物理及生物学特征。结果:连续培养及刮擦方法可获得完整的BMSC膜片。经成骨诱导培养条件下,BMSC仍快速增殖,形成的膜片碱性磷酸酶染色、茜素红、I型胶原等组织化学染色呈阳性,电镜检查见细胞被矿化的细胞外基质包围,透射电镜下可观察到细胞间连接结构,定量分析结果有碱性磷酸酶含量较高,骨相关基因mRNA表达上调。结论:可以通过简单的物理方法从普通培养皿获得细胞膜片,BMSC膜片具有良好的体外成骨能力,有望用来构建骨组织工程。 实验三BMSC膜片片段构建可注射骨的实验研究 目的:由于传统基于单细胞悬液的细胞治疗方法存在诸多不足,本研究探讨利用BMSC膜片片段构建可注射组织工程骨的可行性。方法:将BMSC在成骨诱导条件下连续培养获得细胞膜片,剪切成微小体积的片段,加入无血清培养液混悬,然后注射到裸鼠背部皮下。相同浓度的单细胞悬液和相同体积的无血清培养液作为对照。术后4周,8周分别进行大体观察、三维CT扫描、组织学检查。结果:成骨分化的BMSC膜片片段注射到体内后形成硬质组织,新生物的重量和体积较对照组大,三维CT扫描表现为异位矿化物,密度与裸鼠椎体相类似,组织学检查证实骨组织形成。结论: BMSC膜片片段具有良好的体内成骨能力,可用于构建可注射组织工程骨,无需外源性载体材料。本研究为构建可注射组织工程骨及提高细胞治疗效率提供了全新的思路。 实验四BMSC膜片片段促进兔下颌骨骨折愈合的实验研究 目的:采用下颌骨延迟愈合模型,观察局部注射BMSC膜片片段对骨再生的影响。方法:9只兔(18侧下颌骨)按照干预不同随机平均分为3组(每组6侧):下颌骨截骨后第3天后分别将0.2 mL无血清DMEM、单细胞悬液、细胞膜片片段悬液注射到A组、B组, C组的骨折间隙内。固定6周后处死动物取材进行大体观察、显微CT检查及骨组织学定量分析。结果:C组在阻射密度、骨矿化密度、新生骨体积和面积百分比等方面均优于A组和B组(n=6, P 0.05)。结论:局部注射BMSC膜片片段有效促进下颌骨骨折愈合,为临床上治疗骨不连或延迟愈合提供了一种新的方法。 实验五局部注射BMSC膜片片段促进兔下颌骨牵张成骨的实验研究 目的:采用兔下颌骨牵张成骨模型,观察局部注射BMSC膜片片段悬液对新生骨的影响。方法:32只兔随机分为4组(每组8只兔16侧下颌骨):A组, B组, C组在下颌骨截骨延迟5日后均以0.75 mm/12h的速度延长9 mm,在固定期第1天,分别将0.3 mL无血清DMEM、单细胞悬液、细胞膜片片段悬液注射到双下颌骨的牵张间隙内。D组经相同的截骨和延迟期后以0.5 mm/12h的速度延长9 mm,但不作注射干预。固定期第3和6周末每组分别处死4只动物取材进行大体观察、X线侧位片、显微CT及三点折断试验等检查,同时对新生骨痂行组织学定量分析。结果:C组, D组在X线阻射密度、最大负载值、骨矿化密度、新生骨百分比等方面均明显高A组和B组(n=8,P 0.05)。结论:局部注射BMSC膜片片段可有效促进新生骨的形成,有利于下颌骨牵张成骨的愈合,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一种新的策略。 试验六BMSC膜片构建具有三维体积的特定形态组织工程骨的实验研究 目的:探讨利用BMSC膜片构建较大体积的无外支架组织工程骨的可行性。方法:将BMSC膜片折叠成长方形状的多层膜片复合物,并由一端卷起形成具有一定体积的圆柱状细胞多聚体。静置孵育2小时后将体外构建物移植到裸鼠背部皮下。术后4周,8周分别进行大体观察、三维CT扫描、组织学检查、生物力学评价。结果:组织工程构建物植入体内后形成的硬质组织,较好得保持植入前外形,三维CT扫描表现为异位矿化物,密度与裸鼠椎体相类似,组织学检查证实为骨组织,生物力学测试提示新生组织具有较高的抗压强度。结论:BMSC膜片在体内具有良好的成骨能力,利用它可构建较大体积的组织工程骨,无需外支架。本研究为骨组织工程构建提供了全新的理念。


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