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携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究

蔡磊  
【摘要】: 对于多数不能手术的肝癌患者目前仍无有效治疗手段。近年来以RNA干扰技术为代表的新型肿瘤靶向治疗方法日益受到关注。单链抗体(ScFv)作为一种新型的肿瘤靶向治疗载体显示了良好的应用前景。我们从自行建立的全人源性肝癌ScFv抗体库中筛选到了1株肝癌ScFv,在原核表达系统中诱导表达后得到了可溶性的、具有生物学功能的ScFv蛋白,且通过检测发现其与肝癌细胞有较强的结合能力。鱼精蛋白(protamine)[1-3]是一种富含阳离子的强碱性蛋白,结合DNA的能力强。有研究者应用鱼精蛋白截断体与阳离子脂质体和DNA按照一定比例混合,成功地提高了转染效率。而Survivin[4, 5]是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibition of apoptosis protein,IAP)家族中的一员,对凋亡有极强的抑制作用。研究发现Survivin在肝癌组织中高表达。本研究旨在该肝癌特异性单链抗体ScFv和鱼精蛋白截短体(tP)重组的方法,构建以ScFv区作为靶向肿瘤部位的功能区、以tP作为效应功能区的ScFv/tP融合蛋白,并对该融合蛋白的功能进行鉴定以及研究;同时将ScFv/tP融合蛋白与细胞凋亡抑制基因Survivin特异性siRNA体外孵育形成复合物,检测该复合物对肝癌细胞凋亡的影响,为研究肝癌细胞的生物学特性奠定理论基础,为开发依赖抗体介导的肝癌靶向药物建立研究平台。 实验一: 目的: ScFv/tP融合基因的构建及表达 方法:设计携带相应酶切位点的ScFv引物,经PCR扩增;用限制性核酸内切酶HindⅢ与EcoRⅠ酶切pET28/ScFv,核酸电泳后回收ScFv;人工合成两条tP编码寡核苷酸序列,在其两端带上可以直接与经HindⅢ和XhoⅠ酶切的载体相连接的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的粘端序列。将两条tP缓慢退火后,与从质粒、用EcoRⅠ和XhoⅠ切下的ScFv一起连入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET32a中;将质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞后,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定并测序;将测序正确的重组质粒在大肠杆菌E. coli BL21trxB中诱导表达,利用HisTrap Ni-NTA螯合层析介质纯化所得蛋白,产物经SDS-PAGE鉴定。 结果及结论:经酶切鉴定以及测序证实:扩增的目的基因序列正确,成功构建了含有ScFv/tP的原核表达载体。经SDS-PAGE鉴定,所获得的ScFv/tP融合蛋白大小与预测大小一致,约42 kDa。 实验二: 目的: ScFv/tP融合蛋白的活性功能研究 方法:选用人肝癌细胞HepG2,人正常肝细胞7701等检测ScFv/tP融合蛋白靶向性;间接免疫荧光检测人肝癌细胞HepG2,人正常肝细胞7701对ScFv/tP融合蛋白内吞效果;凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合活性;光学以及荧光倒置显微镜观察ScFv/tP融合蛋白对siRNA的靶向传递情况。 结果:间接免疫荧光检测提示ScFv/tP融合蛋白可内化进入人肝癌细胞HepG2,但不能内化进入人正常肝细胞7701;凝胶迁移阻滞实验提示ScFv/tP融合蛋白具有DNA结合活性;光学以及荧光倒置显微镜观察发现ScFv/tP融合蛋白能够将siRNA靶向传递入人肝癌细胞HepG2,但不能传递入人正常肝细胞7701。 结论:ScFv/tP融合蛋白能够被人肝癌细胞内化进入细胞内,而不能被人正常肝细胞所内化;ScFv/tP融合蛋白既具有肝癌特异的靶向性,又具有DNA结合活性;ScFv/tP融合蛋白能够将siRNA特异性的传递入人肝癌细胞,而不能传递入人正常肝细胞。 实验三: 目的:携带Survivin特异性siRNA的ScFv/tP融合蛋白对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响 方法:流式细胞仪定量分析siRNA与ScFv/tP融合蛋白最佳的转染比例;利用RT-PCR、REAL-PCR和Western-Blot分别在mRNA和蛋白水平检测利用ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对肝癌细胞内Survivin的抑制情况;流式细胞仪定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA的效率;流式细胞仪定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌细胞周期的影响;扫描及透射电镜定性分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对肝癌细胞凋亡的影响;流式细胞仪和TUNEL染色法定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌细胞凋亡的影响;MTT以及台盼兰拒染实验定量分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA对肝癌细胞活性的影响;PCR Array定量分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对凋亡相关基因表达的影响;体内实验:采用裸鼠成瘤实验,测量不同处理组种植瘤的大小,在体内条件下,采用间接免疫荧光检测体内实验检测裸鼠体内肝癌种植瘤细胞对ScFv/tP融合蛋白的内吞效果,采用HE染色法、TUNEL染色法检测ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌种植瘤细胞凋亡的影响,采用RT-PCR和Western Blot检测不同处理组对种植瘤肝癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的抑制情况。 结果:由ScFv/tP融合蛋白介导的Survivin-siRNA转染能够在体内以及体外降低Survivin mRNA以及蛋白的表达水平,且转染后能够在人肝癌细胞HepG2以及裸鼠体内种植瘤细胞中诱导凋亡的发生。 结论:ScFv/tP融合蛋白能够作为转染试剂成功地将siRNA等传递入人肝癌细胞中,影响肝癌的各种生物学活性,从而为肝癌的靶向治疗提供了新的理论以及实验基础。


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