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模拟失重致人脐静脉内皮细胞异常和红花甙修复效应的实验研究

李静  
【摘要】: 航天失重环境可导致机体心血管系统由于重力的消失产生异常,即使宇航员暴露于失重环境的时间十分短暂,心血管系统也会产生一系列适应性变化,并将直接影响宇航员身体健康,严重时会威胁飞行安全。这些由于失重诱发的心血管系统适应性改变的综合症被称作心血管失调(Cardiovascular deconditioning, CD),表现以立位不耐受,心悸,晕厥为主,然而目前关于CD产生机制的阐释仍远远不够明确。内皮细胞不仅是血液与血管组织之间天然的解剖屏障,而且是血管活性器官。血管内皮细胞不仅具有选择通透性、抗血栓、调节血管紧张度、促进毛细血管形成以及产生血细胞粘接因子等功能,而且还是多种血管活性物质、细胞因子以及生长因子的来源和靶器官,血管内皮细胞的损伤与多种心血管功能失调有密切的关系。 近年来,地面模拟研究证实-6°头低位卧床受试者血液中可检测到凋亡的内皮细胞;同时,另有学者在尾部悬吊后肢卸荷模型大鼠的血管组织中检测到高表达的诱导型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS),提示模拟失重可导致内皮细胞可产生多种异常。本研究采用地面二维回转培养器(2D- clinostat)模拟细胞在空间中的受力状态,以地面正常1g重力(Normal gravity, NG)作对照,对模拟微重力(Modeled microgravity, MMG)干预后人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的形态与功能进行多角度评价,为明确内皮细胞损伤可能是介导CD产生的重要机制提供数据支持。大量临床与实验室研究提示:活血化瘀类中药对血管内皮细胞有明确的保护作用并能通过调节其分泌血管活性物质调节血管功能。研究表明,红花甙(Carthamin)可抑制内皮细胞损伤并改善内皮细胞功能。因此,本研究在明确MMG导致内皮细胞损伤的基础上,将进一步采用Carthamin对MMG作用下HUVECs进行干预,观察其逆转与修复效应,为失重致CD的药物防护治疗提供实验依据。 实验一MMG导致HUVECs细胞骨架重构及其对细胞增殖、迁移的影响 目的:观察MMG致HUVECs细胞骨架结构(纤维状肌动蛋白和微管)的改变,并对MMG作用后细胞的增殖、迁移等功能进行评价。 方法:酶消化法原代培养HUVECs,流式细胞术(FCM)进行鉴定,取3~5代的HUVECs进行实验,随机分为2D- clinostat干预的MMG培养组与NG对照培养组,均培养48 h;倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数及流式细胞术分析细胞增殖、凋亡及细胞周期变化;Transwell观察细胞迁移情况;免疫荧光及激光共聚焦观察HUVECs细胞骨架结构。 结果:①HUVECs的培养与鉴定:所培养的HUVECs细胞经流式细胞术鉴定,其CD31与Ⅷ因子为表达较高。②HUVECs骨架观察结果:NG对照组的纤维状肌动蛋白(fibers actin, f-actin)为束状、放射状,其方向感明显,且呈现出具有较多伪足的纤维骨架结构;然而MMG作用48 h后,尽管f-actin没有发生明显的崩解但是其方向感明显消失,并且f-actin的束状纤维也大部分消失;MMG干预48 h使大量的微管蛋白发生解聚,微管的网状结构已经模糊不见,随之代替的是崩解的微管小聚体。③细胞增殖及凋亡检测:MMG可使HUVECs增殖明显抑制,细胞周期抑制于G2/M期(G2/M:MMG, 27.6%, NG, 18.1%;P0.05),然而细胞并没有发生明显凋亡。④细胞迁移检测:MMG干预可使HUVECs的迁移受到抑制,抑制率为-62.7% (P0.05)。 结论:MMG可显著影响HUVECs的形态与细胞骨架结构并抑制其增殖与迁移功能,HUVECs的增殖抑制可能与紊乱的微管结构密切相关。 实验二MMG对HUVECs的FAs形成、定位以及FAs功能的影响 目的:对MMG干预下HUVECs的FAs多种参数进行半定量观测,并对FAs的酪氨酸活化水平进行评价,进一步检测其中关键蛋白激酶和FAs中酪氨酸激酶的主要受体integrins的表达。 方法:激光共聚焦结合高通量激光半定量计算方法,对FAs的各项参数进行评价,其参数包括FAs平均数量(mean vinculin spot number per cell, VN);FAs平均面积(mean vinculin spot area, VA);FAs平均交叠面积(the area percentage of overlap of FAs, OSP);FAs平均到细胞边缘距离(average distance of vinculin spots from the cell edge, DS)。免疫荧光观察酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation , PTyr)水平,Western blot检测FAK,pyk2,ILK的总表达量与磷酸化表达量,Western blot以及RT-PCR检测integrinβ1和β4的表达。 结果:①FAs形态学改变:FAs在MMG干预下,形成的数量(VN)与面积(VA)明显减少,VN较NG对照组减少-50.6% (P0.05),VA较NG对照组减少-60.2% (P0.05),FAs定位指标DS也不同于NG对照组-28.3%(P0.05)。②PTyr水平检测:MMG干预后,FAs的PTyr活化水平明显抑制(-71.3%)(P0.01)。③FAs激酶活性:MMG影响后FAK,pyk2,ILK总蛋白表达没有明显改变,然而其磷酸化水平明显下调,FAK,pyk2,ILK下调量分别为:-27.2%,-30.8%,-36.5% (P0.05)。④integrins结果:MMG可导致integrinβ1和β4在mRNA与蛋白水平表达下调。 结论:MMG可影响HUVECs的FAs的生成以及定位,并且其与integrins相关的酪氨酸活化功能及核心激酶磷酸化水平也明显下调。 实验三Carthamin干预MMG条件下HUVECs形态和功能的实验研究 目的:观察Carthamin对MMG作用后HUVECs的增殖、迁移以及细胞骨架的影响。 方法:MMT摸索Carthamin作用最佳浓度,2D- clinostat进行失重模拟培养HUVECs,实行分组如下:NG对照组,MMG对照组,Carthamin+MMG组。采用细胞计数、流式细胞术检测各组细胞增殖,Transwell检测细胞迁移;观察Carthamin干预后细胞骨架蛋白的改变情况。 结果:①给药浓度:Carthamin的最佳给药浓度为10μg/ml。②细胞增殖检测:MMG可使HUVECs增殖明显抑制,然而Carthamin的干预并没有逆转MMG导致HUVECs细胞增殖抑制的情况。③细胞迁移检测: Carthaminl孵育48 h后,MMG组的迁移情况明显改善,MMG+Carthamin组较MMG对照组迁移细胞数增加了38%(P0.05)。④细胞骨架结果:Carthamin干预后,尽管弥散情况没有明显改善,但我们可观察到细胞的伪足较MMG对照组增多,微管改善不明显,MMG+ Carthamin组仍然显示为弥散的数个微管亚聚体。 结论: Carthamin可明显改善由于MMG作用而导致的HUVECs细胞迁移抑制,并修复由于MMG作用导致HUVECs细胞骨架f-actin的骨架重排现象。 实验四基于FAs以及RhoA对Carthamin修复MMG致HUVECs迁移抑制分子机理的实验研究 目的:观察Carthamin对MMG条件下HUVECs的FAs的影响,以及基于RhoA初步探讨了其在介导Carthamin修复MMG致HUVECs迁移抑制的分子机制。 方法:2D- clinostat进行失重模拟培养HUVECs,Carthamin干预后检测FAs的VA, VN及DS的变化;Exoenzyme C3 Transferase抑制RhoA活性后,检测FAs的PTyr活化情况以及下游蛋白ILK、Cofilin的磷酸化水平。 结果:①FAs形态学结果:Carthamin可显著改善由于MMG导致HUVECs的FAs的形态学变化,采用10μg/ml的Carthamin干预处理后,MMG+Carthamin组的FAs的数量与面积较MMG对照组均明显增加,其中VN增加30.3%(P0.05),VA增加25.8%(P0.05);进一步对FAs的DS进行分析,较MMG对照组MMG+Carthamin组的DS升高了36.4%。(P0.05)。②RhoA阻断迁移结果:Exoenzyme C3干预RhoA活性后,Carthamin的修复效应即被阻断,其迁移细胞数与阻断前比下降33.3%(P0.05),阻断后的HUVECs的迁移能力与MMG对照组没有明显差异。③RhoA阻断PTyr以及ILK、Cofilin的磷酸化水平:行Exoenzyme C3干预后,FAs的PTyr活化水平大幅降低了57.1%(P0.05),此时PTyr活性与MMG对照组相比没有明显差异;同时RhoA的阻断影响了其下游ILK、Cofilin的磷酸化水平,它们也分别下降了41.6%与64.3%。 结论:Carthamin可能通过对FAs的影响以及上调其激酶活性促进MMG条件下HUVECs细胞迁移的,并且该作用可能与RhoA信号分子密切相关。


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