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抗HBV治疗对慢性乙型肝炎患者调节性免疫功能的影响

南雪平  
【摘要】: 慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的发病机制一直是传染病领域研究的重点和难点问题。迄今,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染慢性化以及其持续感染的机制尚未阐明。自20世纪90年代中期以来,慢性乙型肝炎的抗病毒治疗虽然取得了长足的进步,但是现有的抗病毒药物和治疗方案仍然无法从大多数慢性HBV感染者体内彻底清除乙肝病毒。毫无疑问,阐明HBV感染慢性化及持续感染的发生机制对于最终治愈慢性乙型肝炎尤为重要。虽然已零星报道应用抗病毒治疗药物后部分慢性乙型肝炎患者的抗病毒免疫力有所提高,但是目前系统的研究报道甚少,且具体机制不明。本研究主要完成了以下两方面的工作: 一、CHB患者外周血Tregs细胞、CD4+T细胞表面PD-1和BTLA的表达和意义 为了观察慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B , CHB)患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的变化及CD4+T细胞表面PD-1(programmed cell death 1, CD279)和BTLA (B and T lymphocyteattenuator)的表达情况以及其与临床指标的相关性。我们采用密度梯度离心法分离39例CHB患者和19例健康对照者的外周血单个核细胞(PBMC),流式细胞术检测CD4+CD25highTreg细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的比例及CD4+T淋巴细胞表面的抑制性分子PD-1和BTLA的表达,并通过反转录PCR法检测外周PBMC中BTLAmRNA的表达情况。 结果①CHB组CD4+CD25highTreg占CD4+T细胞的百分比为7.38±2.02 %,明显高于正常对照组4.99±1.15%(P0.0001)。HBVDNA定量108copies/mL的患者CD4+CD25highTreg占CD4+T淋巴细胞的百分比(7.75±2.18%),显著高于HBV DNA定量108copies/mL的患者(6.55±2.34%,P 0.05)。 ②CD4+PD-1+占CD4+T淋巴细胞的百分比: CHB患者(58.73±11.11%)与正常对照组(47.75±12.69%)比较具有明显差异(P=0.0013), HBV DNA定量108copies/mL的患者中CD4+PD-1+占CD4+T淋巴细胞的百分比(61.18±12.02%)与HBV DNA定量小于108copies/mL的患者(54.36±7.88%)相比无明显差异(P=0.0552),但HBV DNA定量108copies/mL的患者中CD4+PD-1+占CD4+T淋巴细胞的百分比在数值上高于HBV DNA定量小于108copies/mL的患者。 ③CD4+BTLA+占CD4+T淋巴细胞的百分比: CHB患者(2.79±0.29%)与正常对照组(2.386±0.4810%)比较无明显统计学差异(P=0.085)。在外周血单个核细胞中的BTLA-mRNA的表达在慢性乙型肝炎组为1.097±0.0634,而在正常对照中为1.010±0.1449,两者间无统计学差异(P=0.916)。 ④CD4+CD25highPD-1+T细胞在慢性乙型肝炎患者中(97.78±5.65%)与正常对照(99.11±1.133%)比较无统计学差异(P=0.37),CD4+CD25highBTLA+T细胞在慢性乙型肝炎患者中(9.811±6.013%)与正常对照(13.97±10.84%)比较无统计学差异(P=0.11)。 ⑤CHB患者CD4+CD25high Treg细胞与HBV DNA载量正相关(r=0.3314,P=0.0393),CD4+T淋巴细胞表面的负性调节分子PD-1也与HBV DNA载量正相关(r=0.3712,P=0.02)。 结论CD4+CD25highTreg细胞在CD4+T淋巴细胞中的比例及CD4+T淋巴细胞表面抑制性分子PD-1的升高可能抑制CHB患者的细胞免疫反应,影响病毒的清除,导致HBV感染慢性化。 二抗HBV治疗过程CHB患者外周Treg细胞、CD4+T细胞表面PD-1/PD-L1的表达及单核细胞表面TLR2/TLR4的表达及意义 在前述研究的基础上,对28例接受替比夫定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者不同治疗时间点外周血Tregs细胞的变化、CD4+细胞表面PD-1 /PD-L1的表达和单核细胞表面TLR2/TLR4的表达进行了检测和分析,以期探讨抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者免疫功能的影响。采用密度梯度离心法分离28例患者在基线、治疗后3个月和6个月的外周血获取PBMC,使用流式细胞术检测不同时期外周Treg细胞的频率、CD4+T表面PD-1和PD-L1的表达,单核细胞表面TLR2和TLR4的表达;ELISA试剂盒检测血浆中细胞因子IFN-γ、IL-9的浓度。 结果①CHB患者抗病毒治疗过程中,在基线、治疗3月和6月HBVDN值取对数后的的结果分别为:7.672±0.3055、3.688±0.2711和2.628±0.3176,组间比较具有统计学差异(P0.001,P0.001);丙氨酸氨基转移酶结果分别为:111.7±9.206u/L、68.19±12.38u/L和30.38±3.273u/L,组间比较具有统计学差异(P0.001,P0.001)。 ②CHB患者外周血中CD4+CD25highTreg细胞在基线(10.48±0.4809%)和治疗后3个月(7.290±0.4258%)、治疗后6个月(7.078±0.4274%)比较有明显统计学差异(P0.001,P0.0001),治疗3个月和6个月间无统计学差异;在基线、3个月和6个月CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞百分比分别为:27.95±1.553%、24.03±1.497%、25.69±1.437%,CD4+CD25+Treg细胞亚群的比例在基线和治疗后3个月两者有统计学差异(P=0.0238),其余比较无差异。 ③在基线、治疗后3个月和治疗后6个月的CD4+PD-1+T细胞占CD4+T细胞的百分比分别为:42.52±3.386%、33.19±3.352%和40.08±3.931%,分析发现治疗后3个月较基线明显减低(P=0.0118),余组间无统计学差异;CD4+PD-L1+T细胞亚群的百分比在基线、治疗后3个月和6个月分别为:0.9258±0.2213%、0.4827±0.0909%、0.5258±0.0913%,各组间比较无统计学差异(P=0.0747、P=0.0631),但治疗后较基线在数值上较低较明显。 ④CHB患者在基线、治疗后3个月和6个月TLR2的平均免疫荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)分别为:89.07±6.089、96.12±8.803和102.9±6.633,经统计学分析后发现治疗后6个月较基线明显增加(P=0.0399),余组间无统计学差异;TLR4的MFI分别为:41.17±2.397、38.20±2.125、40.48±2.371,经统计学分析后发现各组间无显著差异(P0.05)。 ⑤经检测20例CHB患者血清中的IFN-γ在基线、治疗3个月和6个月的血浆浓度分别为:24.49±3.862 pg/ml、21.86±2.873 pg/ml、27.28±6.581 pg/ml,各组间比较无明显统计学差异(P0.05),但治疗后6个月血中IFN-γ的浓度值较基线和3个月升高;血浆中的IL-9浓度分别为:30.89±5.279pg/ml、25.80±4.159 pg/ml、12.76±2.524 pg/ml,治疗后3个月、6个月较基线明显下降(P=0.010、P=0.0086)。 结论抗病毒治疗使HBV病毒定量下降和肝功能恢复的同时,可能部分的恢复损伤的免疫系统的功能,表现为循环Treg细胞和PD-1的下降。TLR2可能在抗病毒治疗中也起到一定作用,具体机理需进一步研究证实。


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