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SIGIRR在LPS诱导的人肺泡II型上皮细胞(A549)急性炎症反应中的作用

田丰  
【摘要】: 【课题研究的目的与意义】在急性肺损伤(ALI)以及其他多种肺部急性炎性疾病的致病机理中,LPS-TLR4信号通路被认为起着核心作用,因此抑制这一信号通路对减轻ALI有着重要意义。目前发现的可抑制TLR4的分子中,单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)是其中一员。其可通过与TLR4结合作用从而抑制LPS信号。由于既往研究未阐明SIGIRR是否表达于人肺泡上皮细胞,故本研究从检测SIGIRR在人正常肺泡上皮细胞中的表达开始,探讨SIGIRR在肺泡上皮细胞急性炎症反应中的作用。【方法】采用免疫组化、RT-PCR及Western blot的方法,从组织、蛋白及mRNA三个水平分别检测了人正常肺组织以及肺泡II型上皮细胞来源的永生肺腺癌细胞系A549中SIGIRR的表达情况。选用LPS作为刺激因素,采用实时定量PCR及定量Western blot检测A549细胞中SIGIRR mRNA及蛋白表达水平的动态变化。构建含SIGIRR全长cDNA的真核表达载体并转染A549细胞使其过表达SIGIRR,采用双萤光素酶报告系统研究SIGIRR对LPS导致的NF-kB激活的影响,经过ELISA法研究SIGIRR在A549细胞中对LPS引起的细胞因子生成的影响,通过MTT检测了SIGIRR过表达后LPS刺激下A549细胞的生长与存活情况。【结果】经免疫组化染色检测,20例肺组织标本中肺泡上皮细胞均有SIGIRR表达;经RT-PCR检测,20例肺组织标本及A549细胞均在433bp处可见条带;Western blot检测到SIGIRR蛋白表达于正常肺组织及A549细胞,A549细胞中SIGIRR蛋白的分子量大小与正常肺组织中相同。通过实时定量PCR发现在LPS刺激后3 h, 6 h及12h,SIGIRR mRNA水平较刺激前显著降低;但是刺激后24h,SIGIRR mRNA又恢复至刺激前水平;通过定量Western blot分析发现刺激前与刺激后3h、6h、12h之间SIGIRR蛋白表达水平无统计学差异,刺激后24h,蛋白表达显著低于前几个时间点。A549细胞过表达SIGIRR后,其NF-kB转录活性在LPS刺激后各时间均显著低于对照组,细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的水平亦显著低于对照组,过表达SIGIRR的A549细胞经LPS刺激后各时间点生长抑制率显著低于对照组。【结论】SIGIRR表达于人正常肺泡上皮细胞,并参与了LPS诱发的肺泡上皮急性炎症反应并起到负性调节作用,有助于细胞的生长及存活。


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