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转染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3细胞促大鼠移植组织血管化

郑岩  
【摘要】:血管新生在创伤愈合、器官移植及组织工程等领域具有重要作用,它是一个需要多种细胞和生长因子协同发挥作用的过程。 如何通过生物刺激获得成熟的新生血管一直是令人困扰的难题。以往通过局部或全身给予VEGF诱导血管形成的方法会使血管的通透性增高,导致患者血压降低,而且新生的血管大部分没有正常功能。为了解决这一问题,一些研究采用多种生长因子联合应用的方法,即同时提供促血管形成的信号和促血管成熟的信号,获得了令人满意的效果。然而多种生长因子联合应用会增加治疗的成本,而且各种因子间的相互作用也没有研究清楚。HIF-1α是一种能激活许多缺氧反应性基因表达的转录因子,它具有一个氧敏感降解区(ODD),敲除ODD后HIF-1α在常氧下稳定,可以调节多种生长因子高表达。一些研究证实通过转敲除ODD的HIF-1αΔODD基因治疗,在多种组织中获得了大量成熟的新生血管。本课题拟比较HIF-1αΔODD基因和VEGF基因对血管形成的作用。 基因治疗具有良好的临床应用前景,但是如何安全有效地将目的基因转入宿主体内仍是未解的难题。直接注射病毒的方法转染率低,易丢失,还会引起宿主的免疫反应。以细胞作为目的基因的载体可以克服以上不足,应用这一策略治疗缺血性疾病获得了很好的效果。成纤维细胞易培养且免疫源性低,异种成纤维细胞在宿主内可存活2-8周,这段时间对于促血管形成已经足够,而且异种的成纤维细胞最终会被宿主排斥,不会引起血管瘤等肿瘤形成,因此很安全。本课题拟采用异种成纤维细胞作为基因载体。 带蒂皮瓣移植是临床常用的组织修复方法之一,然而皮瓣需要至少3周的时间才能断蒂。自体游离脂肪组织移植被用于充填颜面部的凹陷畸形和隆乳等多种手术,但自体脂肪组织移植存活率低。如能在术后及时重建血运,则带蒂皮瓣断蒂时间可缩短,脂肪存活率可提高。本课题拟选择大鼠带蒂皮瓣转移和自体脂肪移植作为实验模型。 本课题的研究目的是探讨移植转染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3细胞对缩短大鼠带蒂皮瓣断蒂时间的作用和对提高自体脂肪移植成活率的作用;通过观察NIH3T3细胞在大鼠体内存活的时间,探讨异种成纤维细胞作为基因载体发挥短期作用的可能性;通过观察皮瓣和脂肪的血管密度和成熟度,比较HIF-1αΔODD基因和VEGF165基因的促血管新生的作用。 实验一重组慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP的构建 目的:构建重组慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP,并进行鉴定。方法:设计引物,在目的基因HIF-1αΔODD的上游引入SmaI酶切位点,下游引入NheI酶切位点,对质粒pCEP4/HIF-1αΔODD进行不对称PCR,PCR产物跑电泳,切胶回收,用SmaI和NheI双切,产物跑电泳,切胶回收。用SmaI和NheI双切中间载体pRRLsin/LacZ alpha(+),回收大片段。产物连接,转化,得到pRRLsin/HIF-1αΔODD/EGFP质粒。PCR鉴定,酶切鉴定,测序。将pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pRRLsin/HIF-1αΔODD/EGFP4种质粒共转染293T细胞,收上清。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果与预期结果符合。结论:成功构建了重组慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP。 实验二重组慢病毒Lenti/VEGF165/EGFP的构建 目的:构建重组慢病毒Lenti/ VEGF165/EGFP,并进行鉴定。方法:设计引物,在目的基因VEGF165的上游引入SmaI酶切位点,下游引入NheI酶切位点,对质粒pcDNA3.1(-)/VEGF165进行PCR,PCR产物跑电泳,切胶回收,用SmaI和NheI双切,产物跑电泳,切胶回收。用SmaI和NheI双切中间载体pRRLsin/LacZ alpha(+),回收大片段。产物连接,转化,得到pRRLsin/ VEGF165/EGFP质粒。PCR鉴定,酶切鉴定,测序。将pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pRRLsin/ VEGF165/EGFP4种质粒共转染293T细胞,收上清。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果与预期结果符合。结论:成功构建了重组慢病毒Lenti/ VEGF165/EGFP。 实验三重组慢病毒体外转染NIH3T3细胞 目的:分别获得稳定转染HIF-1αΔODD、VEGF165和EGFP基因的NIH3T3细胞系。方法: Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP、Lenti/VEGF165/EGFP和Lenti/EGFP分别转染NIH3T3细胞,流式细胞分选,定量PCR、Western Blot和ELISA检测。结果:定量PCR、Western Blot和ELISA检测证实Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞高表达小鼠VEGF、bFGF和Ang-1蛋白,Lenti/VEGF165/EGFP转染的NIH3T3细胞高表达人VEGF165蛋白。结论:获得了3个稳定转染的细胞系:Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞、Lenti/VEGF165/EGFP转染的NIH3T3细胞和Lenti/EGFP转染的NIH3T3细胞。 实验四观察NIH3T3细胞在大鼠体内的存活时间 目的:探知NIH3T3细胞在大鼠体内的存活时间。方法:将Lenti/EGFP转染的NIH3T3细胞和CM-DiI标记的NIH3T3细胞分别注射到大鼠皮下,分别于注射后第1、2、3、4周掀起皮瓣荧光显微镜下观察。结果:第1-3周镜下观察到数量基本相同的发荧光的细胞,第4周数量明显减少。Lenti/EGFP转染组和CM-DiI标记组观察结果一致。结论:NIH3T3细胞在大鼠体内的至少可以存活3周。 实验五转染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3细胞大鼠促皮瓣血管化 目的:观察Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞对缩短大鼠带蒂皮瓣断蒂时间的作用。方法:将A组Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞、B组Lenti/VEGF165/EGFP转染的NIH3T3细胞和C组(对照组)Lenti/EGFP转染的NIH3T3细胞分别注射到大鼠背部带蒂皮瓣下,并于4天断蒂,检测皮瓣的成活率。通过计数CD31(血管内皮标志)阳性的血管,比较各组的血管密度。通过计算SMA(血管平滑肌标志)阳性的血管的百分比,比较各组的血管成熟度。ELISA检测血清中生长因子含量。结果:A组和B组大鼠皮瓣4天断蒂后皮瓣100%成活,C组约40%成活。血管密度A组是C组的3倍,B组是C组的4倍;血管成熟度A组约53%,B组约10%,C组约39%。结论:移植Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞到大鼠皮瓣下可以促进血管新生和成熟,缩短皮瓣断蒂时间。 实验六转染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3细胞促大鼠移植脂肪血管化 目的:观察Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞对提高大鼠自体移植脂肪成活率的作用。方法:将A组Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP转染的NIH3T3细胞、B组Lenti/VEGF165/EGFP转染的NIH3T3细胞和C组(对照组)Lenti/EGFP转染的NIH3T3细胞分别混入大鼠自体脂肪颗粒中,脂肪移植到背侧皮下,于6个月后检测移植脂肪的成活率、通过HE染色和免疫荧光染色检测各组的血管密度。结果:A、B、C三组的移植脂肪组织存活率分别为99.3%,76.7%,20.0%。血管密度A组是C组的5倍,A、B两组间无显著差异。结论:移植转染Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP的NIH3T3细胞对移植脂肪组织的血运重建有明显的促进作用,提高了移植脂肪的成活率,其作用优于移植转染Lenti/VEGF165/EGFP的NIH3T3细胞。


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