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UTP对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响

樊磊  
【摘要】: 三磷酸腺苷(ATP)作为细胞外信号分子的功能早已受到人们的关注并得到研究确认,很多类型的细胞在一定条件下均可释放ATP等核苷酸分子;ATP还是神经末梢递质,参与神经兴奋传导。由于核苷酸类受体的多样性以及物种间的差异,胞外核苷酸及其受体的生理功能还不是非常明确。 胞外尿苷三磷酸(UTP)与ATP同是信号递质,参与机体生理病理过程的调节。P2受体是嘌呤与嘧啶受体(P receptors,receptors for purines and pyrimidines)的一大类,其内源性配体主要是ATP和UTP以及它们的水解产物。P2受体分为配体门控离子通道受体——P2X受体和G-蛋白偶联离子通道受体——P2Y受体,这两类受体又有诸多亚型。这些受体亚型虽然结构相似但生理功能及药理性质有很大差异,并且各种亚型之间对于同种配体的亲和力不同。 与ATP相比,对于UTP也是一种细胞外信号分子的认识较晚,细胞可自分泌或者旁分泌UTP的假说最近才得到实验支持,UTP的研究成为了新的热点。细胞持续释放UTP以维持正常的生理功能,在一些病理情况下细胞也可释放UTP,例如心肌梗塞后冠脉窦血液中的UTP浓度升高.。研究发现, UTP预处理的心肌细胞对缺氧/复氧损伤的耐受性提高,在体实验表明UTP可改善大鼠心肌梗塞后的心脏功能和形态学指标。UTP预处理保护心肌的作用机制还不明确,而且,尿苷的类似物腺苷可通过触发/介导缺血预处理效应而保护心肌。本研究旨在明确介导UTP心肌预保护效应的受体以及阐明其可能的机制。 本研究分为两部分: 一、间接体内实验:即活体给药后的离体心脏灌流实验实验目的:探讨P2Y受体激动剂UTP对于大鼠心脏缺血/再灌注损伤(I/RI)的延迟性保护作用。 实验方法:将24只SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为4组:对照组(静脉注射9 g/L生理盐水)、UTP组(静脉注射UTP 4.4μg/kg)、UTP+苏拉明(suramin,SRM)组(静脉注射4.4μg/kg UTP前5 min注射30μg/kg SRM)及SRM组(静脉注射30μg/kg SRM)。所有大鼠尾静脉给药24 h后,建立Langendorff离体心脏灌流模型。平衡10 min后全心停灌,25 min后复灌,持续再灌注40 min。记录心脏缺血/再灌注前后血流动力学指标,观察心肌超微结构,记录心脏表面心电图计算心律失常的发生频率,收集冠脉流出液,用全自动生化分析仪测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。将剩余心肌组织用4%多聚甲醛溶液固定后包埋切片,免疫荧光染色确认成熟大鼠心脏中是否存在P2Y2受体和P2Y4受体。 实验结果:复灌后心脏复跳的第5 min和25 min时,UTP组的左室发展压(LVDP)、等容收缩期左心室内压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)恢复率均优于对照组(P0.01);冠脉流出液中LDH的水平明显值降低(P0.01);复灌第5-15 min和第25-35min时的心律失常的发生频率均显著下降(P0.01);心肌超微结构的损伤减轻。而以SRM与UTP同时作用后,UTP对心脏的保护作用则被取消。SRM组与对照组相比各项指标无明显变化。心肌组织切片的免疫荧光染色表明,成熟大鼠的心肌确实分布有P2Y2受体和P2Y4受体。结论:UTP预处理可对心脏I/RI产生延迟性拮抗作用;而P2Y受体拮抗剂SRM可取消这种作用,表明UTP对心脏的保护作用是通过P2Y受体介导的,由于UTP对P2Y2受体和P2Y4受体亲和力较高且这两种受体广泛分布于成熟大鼠的心肌,那么UTP的心肌保护作用可能是通过这两个P2Y受体的亚型介导的。 二、心肌细胞实验 实验目的和方法 1、ATP对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响 目的:通过观察ATP预处理心肌细胞是否和UTP一样具有拮抗缺氧/复氧损伤的作用探讨介导UTP类物质心肌保护作用的P2Y受体亚型。 方法:实验分组:①正常对照组;②阳性对照组即缺氧/复氧组(缺氧12h,复氧4h);③低剂量ATP预处理组(缺氧/复氧处理前24h加3μM ATP);④中剂量ATP处理组(ATP15μM );⑤高剂量ATP(ATP 50μM)。用全自动生化分析仪检测细胞复氧液中LDH的释放量。 2、UTP对心肌细胞缺氧/复氧后细胞凋亡的影响 目的:通过流式细胞仪检测UTP对于心肌细胞缺氧/复氧损伤引起凋亡的抑制作用。 方法:实验分组:①正常对照组;②阳性对照组即缺氧/复氧组(缺氧12h,复氧4h)③UTP预处理组(缺氧/复氧处理前24h加50μM UTP);④UTP和SRM处理组(SRM 300μM,15min后加UTP50μM)。收集缺氧/复氧处理后的心肌细胞,进行流式细胞仪检测。 3、Ca2+在UTP保护心肌缺氧/复氧损伤中的作用目的:明确细胞外Ca2+在P2Y受体介导的UTP心肌预保护中的作用。方法:实验分组:①正常对照组;②阳性对照组即缺氧/复氧组(缺氧12h,复氧4h);③含Ca2+培养基UTP预处理组(缺氧/复氧处理前24h加UTP 50μM);④无Ca2+培养基UTP处理组(缺氧/复氧处理前24h用无钙培养基置换原有培养基,加UTP50μM,再加入含钙培养基)。用全自动生化分析仪检测细胞复氧液中LDH的释放量。 实验结果: 1、ATP预处理的心肌细胞缺氧/复氧后,与对照组相比,低剂量组和中剂量组细胞培养液中LDH的释放量没有差别,高剂量组的LDH释放量增多。 2、UTP预处理的心肌细胞凋亡早期百分率较对照组明显降低,而SRM与UTP合用时,凋亡早期的心肌细胞百分率升高。 3、与对照组相比,无Ca2+培养基和含Ca2+培养基中的心肌细胞在缺氧/复氧处理后LDH的释放量均减少。而无Ca2+培养基组和含Ca2+培养基组之间LDH的释放量没有显著性差异。 结论: 1、ATP预处理不能产生心肌预保护作用,由于大鼠P2Y4受体与UTP和ATP的亲和力相当而P2Y2受体对ATP的亲和力较UTP差,那么可推断UTP的心肌保护作用主要是由P2Y2受体介导的。 2、UTP预处理可通过抑制细胞的凋亡而保护心肌细胞。 3、UTP作用于无Ca2+培养基中的心肌细胞后细胞抗缺氧/复氧损伤的能力并不降低说明该效应不依赖胞外Ca2+的内流。


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