线粒体融合、分裂在锰诱导的PC12细胞损伤中的作用及其机制的初步研究

【摘要】： 【背景】 锰(Mn)是人体必需微量元素之一,参与许多生理过程,但如果摄取过多则会产生毒性作用。锰的慢性毒性主要表现为锥体外系神经功能障碍,症状类似帕金森病的临床表现。 线粒体在细胞生物活动中扮演着重要的角色,线粒体缺陷与多种疾病有关。锰对线粒体具有特殊的亲和力,线粒体内蓄积的锰可通过多种途径引起线粒体损伤,导致线粒体功能障碍。已有研究证实线粒体功能障碍与神经退行性疾病的发生关系密切。 线粒体是高度动态的细胞器,处于频繁的融合与分裂过程,但是其生理意义尚不清楚。线粒体融合分裂的平衡对线粒体形态和功能的保持有着非常重要的作用,线粒体融合分裂异常总是伴随线粒体功能障碍。线粒体分裂增多导致线粒体片段化,同时线粒体出现损伤,而线粒体融合增多可以改善线粒体功能,对细胞可能起到一定的保护作用。锰可通过多种途径引起线粒体功能障碍,所以推测线粒体融合分裂可能参与了锰的神经损伤过程。 线粒体融合分裂是由特定的分子执行的。Mfn1和Mfn2是线粒体融合的主要执行分子,OPA1也参与了这个过程。Mfn1和Mfn2全部缺失时,线粒体融合现象消失,线粒体管网状结构消失,线粒体功能出现障碍。OPA1介导线粒体内膜的融合,OPA1表达抑制,可致细胞凋亡。Drp1和Fis1是线粒体分裂的重要执行分子。Drp1是线粒体分裂的必需分子,Fis1介导线粒体分裂是依赖Drp1实现的。 【目的】 研究锰对细胞的损伤作用,从线粒体融合、分裂角度探讨锰对神经元的影响及其在锰诱导的神经毒性中的作用,从而为进一步阐明锰神经毒性的机制以及为锰中毒预防和治疗提供科学依据。【方法】1)利用高分化型PC12细胞作为多巴胺能神经元的细胞模型。2)应用倒置显微镜、MTT方法、细胞计数方法、透射电镜分析锰对细胞形态、生存活力以及生长增殖能力的影响。3)线粒体功能检测试剂盒检测锰对线粒体功能的影响。4)用Mito Tracker线粒体荧光探针标记线粒体,荧光显微镜观察线粒体形态变化,透射电镜观察线粒体超微结构变化。5)用Western blot技术检测锰对细胞线粒体融合、分裂蛋白表达的影响。6)利用脂质体介导的基因转染法将预先合成的Drp1 siRNA转染PC12细胞。 【结果】 1)锰对PC12细胞的损伤作用 MTT、细胞计数结果显示,锰作用使细胞生存活力下降,这种作用存在浓度-时间依赖效应。倒置显微镜检测结果表明锰作用细胞皱缩,细胞轴突变短及细胞漂浮现象。电镜检测可发现锰作用后细胞活性差。 2)线粒体融合分裂在锰诱导细胞损伤中的作用 锰诱导PC12细胞损伤,线粒体功能受到影响。线粒体功能检测显示线粒体膜电位减低、线粒体呼吸链酶Ⅱ、Ⅴ活性下降,ATP生成降低。同时,线粒体形态发生改变。细胞荧光显微镜显示,对照组细胞线粒体长度均匀,长管状或短小的线粒体较少。锰作用后,长管状线粒体量明显减少,大部分线粒体呈点状(片段化),并且细胞变圆,皱缩,细胞胞体变大,突触变短甚至消失。线粒体融合分裂蛋白检测显示线粒体融合蛋白Mfn2减低、分裂蛋白Drp1显著增高。说明线粒体分裂相对增多,融合减少。 3)Drp1蛋白在锰诱导的细胞损伤中的重要作用 锰作用于PC12,细胞生长增殖抑制;线粒体分裂增多;线粒体分裂蛋白Drp1表达显著增高。转染Drp1 siRNA细胞,加锰作用后,Drp1 siRNA细胞与空白质粒转染细胞比较,细胞活力增加,锰对细胞的增殖抑制作用减低;Drp1 siRNA细胞线粒体形态有所恢复,长管状线粒体增多,呈点状线粒体明显减少,线粒体融合增多。说明Drp1蛋白在锰诱导的细胞损伤中重要作用。 【结论】 1)锰诱导PC12细胞损伤,细胞生长增殖抑制。这种作用可能是通过线粒体途径调节的,线粒体功能损伤伴随细胞损伤过程,表现为线粒体膜电位减低、线粒体呼吸链酶Ⅱ、Ⅴ活性下降,ATP生成降低。 2)线粒体融合、分裂过程参与了锰诱导PC12细胞损伤过程,并且与线粒体功能障碍密切相关。锰作用使线粒体分裂增多,细胞损伤,活力下降,细胞增殖抑制。 3)初步证实了Drp1蛋白在锰诱导的PC12细胞损伤过程中可能起到重要作用。 综上所述,本实验初步阐明了锰对多巴胺能神经元线粒体形态和功能的影响,线粒体融合分裂在锰诱导的多巴胺能神经元损伤过程中的重要作用,为进一步阐明锰神经毒性的分子机制以及探寻有效的防护措施提供实验依据。