A/E大肠杆菌疫苗动物模型的研究：兔大肠杆菌基因工程疫苗

【摘要】： 致病性和出血性大肠杆菌（代表株EPEC E2348和EHEC O157）是婴 幼儿腹泻、出血性结肠炎和尿路感染综合症（尿毒症）的主要病原菌，它 们同属于粘附脱落（Attaching/Effacing，A/E）大肠杆菌群。它们具有许多 共同的毒力基因，定位于致病岛LEE（The locus of enterocyte effacement） 上。目前针对LEE上毒力基因和相关基因（如eae，esp，ler，lux，Tir等） 构建了多种基因缺失株，研究这些毒力基因及相关基因的功能和调节机制。 研制针对这类大肠杆菌疫苗所遇到的关键问题之一是尚未建立人A/E大肠 杆菌疫苗动物模型。因此，建立大肠杆菌动物模型是研制人A/E大肠杆菌 疫苗的前提和基础，通过对动物A/E大肠杆菌致病机理的研究，不但可以 揭示大肠杆菌主要毒力基因的结构与功能，了解A/E大肠杆菌的致病机理 和免疫反应，而且可以评价疫苗的免疫效果，为人A/E大肠杆菌疫苗的研 制提供研究方案和技术路线。 本文主要对A/E大肠杆菌致病岛LEE的两个主要调节基因lux和ler基 因进行了研究。研究了这两个调节基因对细菌致病性和免疫原性的影响。 所使用的始发菌株为兔致病性大肠杆菌RDEC-1和REPEC O103，根据同源 重组的原理，利用自杀性载体pCVD442技术，敲除了位于染色体上的lux 和ler基因。构建了RDEC-1 luxS基因缺失株，研究了luxS调节基因对RDEC-1 生长特性和致病作用的影响，证实RDEC-1 luxS基因缺失突变株仍然具有 一定程度的致病作用。1uxS基因的缺失可以阻止自诱导蛋白（Autoinducer） 的生成，但不足以使RDEC-1的致病性降低到弱毒疫苗所允许的程度。成 功地构建了REPEC O103 ler基因缺失突变疫苗株，研究了ler基因对REPEC O103生长速率和密度的影响，证实ler调节基因的缺失可导致细菌生长速 率加快、细菌密度提高，而这种ler基因缺失对细菌生长速率和密度的正调 控作用可以为ler基因的互补而逆转。用该基因缺失突变株所进行的安全性 和免疫攻毒试验证实，该突变菌株安全性好，单剂量免疫即可提供完全的 免疫保护作用，可以保护动物抵抗REPEC O103强毒攻击，可以作为REPEC O103弱毒疫苗候选菌株。还成功构建了RDEC-1 ler基因缺失突变株。研究 证实ler基因在RDEC-1和REPEC O103菌株中对细菌生长速率和密度有相 同的调节作用。其安全性和免疫攻毒试验证实，该突变菌株口服免疫接种 可以完全保护动物抵抗RDEC-1 H19A的强毒攻击，可以作为RDEC-1弱毒 疫苗候选菌株。通过本研究，建立了A/E大肠杆菌兔模型，构建了人EHEC 和EPEC模拟菌株及其疫苗菌株，评价了疫苗免疫效果。REPEC O103 ler 基因缺失突变株的构建及其致病性以及免疫保护作用的研究，确定了ler调 节基因在构建A/E大肠杆菌疫苗中的关键作用，为人A/E大肠杆菌弱毒疫 苗的构建指明了方向，并提供了切实可行的技术路线。