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新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究

丁壮  
【摘要】: 从我国部分地区分离、鉴定了23株新城疫病毒(NDV),并对其部分生 物学特性进行了研究。这23株NDV均能凝集鸡和人(O型血)的红细胞, 对猪、山羊、绵羊、牛和马的红细胞凝集作用有差异。分离、鉴定的23株NDV, 电镜下呈现圆形或椭圆形,直径100-500nm,囊膜上有长约8-10nm的纤突。 NDV分离株及F_(48)E_8经鸡胚成纤维细胞培养,形成稳定的病毒蚀斑。血凝解脱 及血凝素热稳定试验表明,四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8为快速解脱型, 血凝素热稳定性差,而长春株为慢速解脱型,血凝素热稳定性好。鸡胚平均致 死时间(Mean Death Time of chicken embryos,MDT)、脑内致病指数 (Intracerebral Pathogenicity Index,ICPI)和静脉致病指数(Intravenous Pathogenicity Index,IVPI)的检测结果表明,长春株是弱毒株(MDT大于168h、 ICPI为0.25、IVPI为0),四平株(MDT为61.2h、ICPI为1.45、IVPI为1.96)、 昌黎株(MDT为64.5h、ICPI为1.45、IVPI为2.48)是中强毒株,青岛株(MDT 为57.9h、ICPI为1.65、IVPI为2.75)为强毒株。 参考有关文献,设计并合成了一对特异引物。应用RT-PCR,一次性扩增 了NDV四平株、昌黎株、青岛株、长春株和F_(48)E_8(国家标准NDV强毒)的全 长HN基因。扩出的四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8HN基因均为1713bp, 编码571个氨基酸,其中四平株和F_(48)E_8HN基因有5个糖基化位点,青岛株 和昌黎株HN基因有6个糖基化位点,四平株有12个半胱氨酸残基,而昌黎 株、青岛株和F_(48)E_8HN基因含有13个半胱氨酸残基。从同源性分析和系统发 育进化树结果来看,野生毒四平株、青岛株、昌黎株与F_(48)E_8相比较,氨基酸 序列同源性分别为98.8%、89.7%、89.8%,而国外强毒株Tex.GB、Miyadera、 Italien与标准强毒F_(48)E_8氨基酸序列同源性分别为87.6%、90.9%、91.1%,说 明国外强毒株与国内标准强毒株在HN基因上同源性并不是很高,而国内分离 毒四平株与F_(48)E_8在HN基因上有非常高的同源性,而青岛株、昌黎株与四平 株比较,与F_(48)E_8相差近10个百分点,说明国内不同地区的NDV分离株HN 基因的同源性相差是很大的,用一种或两种标准强毒制成的疫苗用于防制新城 疫难免会出现免疫学上的偏差,而用国内不同地区分离的、同源性不一致的、 以基因Ⅶ型为主、辅以Ⅷ型及老基因型(Ⅰ~Ⅵ)、加上我的特有的基因Ⅸ型 新城疫病毒HNffi白基因的克降、序列分析、表达及其免疫原件叭究 怕 NDV F。止卜 F。术。等)流行毒株制成的 NDV多价灭活苗代替国外进 L]的 灭活油苗来防制我国鸡新城疫的发生可能会更有针对性,防制效果会更好。 长春株HN基因为173fop,编码577个氨基酸,有5个糖基化位点,门 个半脱氨酸残基,NDV长春株与 Lasota、Queensland V4、D26厂6和 UlSter % 弱毒株的 HN基因的氨基酸同源性在 98.8%~93.4%,系统发育进化树也协J川\ 非常近的亲缘关系。王兴龙等研究表明,**V长春株F基因裂解位点区门门- 117)的氨基酸组成为 Gly-Arg-Gin-GlyArg*eu,与所有弱毒株在这一区域的序 列Gly,Arg/Lys-Gin-Gly/Ser-Afg-Leu十符。由此更进一步证实长春株为弱毒株。 我国目前还没有研究低毒力**V弱毒株的报道,此弱毒株的发现将为我的研 制自己的弱毒疫苗提供疫苗候选株。 将 NDV四平株和长春株 IIN基因亚克隆进入 pFastBac,构建了重组转 座载体phst HN,通过转座得到了重组表达载体pBacmid HN,后者转染昆虫 细胞后产生重组杆状病毒。重组杆状病毒在昆虫细胞中成功地表达了u蛋 白。经SDS-PAGE和Western七*检测,表达的HN蛋白分子量为74kDa川。昆 虫细胞内糖基化X 还有一个67kDa的小蛋白(未糖基化X 与国外报道结来 致。 NDV四平株,青岛株,昌黎株,长春株和NDV F化止;株重组 HN蛋白二 倍连续稀释后,按6一微量法测定血凝效价,结果HA值分别为2‘、2‘、2‘’、 2’、2‘,应用抗NDV HN单克隆抗体做血凝抑制试验,HI效价分别为2‘、2’、 2’、2’、2’。结果表明,表达的重组HN蛋白均具有良好的血凝活性,1{这 种血凝活性能够被抗NDV单抗所中和。 用 NDV四平株和长春株表达的 HN重组蛋白分别免疫 15 H龄雏鸡,免 疫两次,间隔两周。免疫剂量为600U令只,第一次加弗氏亢全佐剂,第 欣 加弗氏不完全佐剂。同时设新城疫V4油苗对照组和 F。术s攻毒组。统计临床 发病与兔疫保护情况,用间接ELISA检测抗HN蛋白抗体效价,用HA爿 检 测血凝抑制抗体效价。结果表明,F。术s攻毒组20只鸡经过4天的潜伏期后, 全部发病,8天内全部死亡,油苗对照组20只鸡全部存活,四平株HN r


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