新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究

【摘要】： 本研究对我国新城疫病毒（Newcastle Disease virus NDV）昌黎株 进行了分离、鉴定和部分生物学特性研究。MDT和ICPI的测定结果表明， 分离到的NDV昌黎株是中强毒株。 利用合成的引物和Random 9mers随机引物，通过RT—PCR扩增了NDV 昌黎株部分F基因（813bp），将其定向克隆进入pKSF质粒（由本室构 建），并进行了序列测定和序列分析。结果表明，克隆的F基因序列长度 为813bp，编码261个氨基酸，含4个半胱氨酸残基和2个糖基化位点。 NDV昌黎株部分F基因和推导的氨基酸序列与国内外13株NDV F基因同一 区域进行了同源性分析。核苷酸序列同源性在84.1％～97.5％，推导的氨基 酸序列同源性在85.8％～93.9％。系统发育分析表明，NDV昌黎株与国内四平 株在同一亚群。NDV昌黎株F蛋白裂解位点区（112～117aa）氨基酸序列为 R-R-Q-K-R-F，与强毒株在这一区域的序列（112R-R-Q-R/K-R-F117）相 符，证明NDV昌黎株是强毒株。 将克隆的NDV昌黎株部分F基因序列与四平株完整的F基因相应区域 进行置换，获得重组F基因，其长度为1754bp，含完整的开放读码框 （ORF），编码553个氨基酸。 用新型杆状病毒表达系统—Bac to Bac系统表达了重组F基因。首先 将重组F基因亚克隆入pFastBacⅠ质粒，构建了重组质粒pFrF。pFrF转化 大肠杆菌DH10Bac后，重组F基因在助手质粒（helper plasmid）帮助 下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid（re-Bacmid）。在含有X- gal/IPTG和三抗（庆大霉素、卡那霉素、四环素）的琼脂平板上挑选白色 菌落，提取re-Bacmid，转染sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid 经复制、表达、装配，形成了重组杆状病毒，经SDS-PAGE和Western blot 分析，重组蛋白获得表达，分子量约为63KD，表达的重组蛋白约占细胞总 蛋白的8.5％。 用表达的重组F蛋白免疫15日龄雏鸡，每只鸡约240μg，分别于免疫 后7、14、21天采血，分离血清，用间接ELISA测定抗体效价，并于免疫 后21天进行攻毒。结果表明，免疫的雏鸡体内可产生抗NDV抗体，能够抵 抗NDV强毒的攻击，保护率达80％。