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新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究

米志强  
【摘要】: 本研究对我国新城疫病毒(Newcastle Disease virus NDV)昌黎株 进行了分离、鉴定和部分生物学特性研究。MDT和ICPI的测定结果表明, 分离到的NDV昌黎株是中强毒株。 利用合成的引物和Random 9mers随机引物,通过RT—PCR扩增了NDV 昌黎株部分F基因(813bp),将其定向克隆进入pKSF质粒(由本室构 建),并进行了序列测定和序列分析。结果表明,克隆的F基因序列长度 为813bp,编码261个氨基酸,含4个半胱氨酸残基和2个糖基化位点。 NDV昌黎株部分F基因和推导的氨基酸序列与国内外13株NDV F基因同一 区域进行了同源性分析。核苷酸序列同源性在84.1%~97.5%,推导的氨基 酸序列同源性在85.8%~93.9%。系统发育分析表明,NDV昌黎株与国内四平 株在同一亚群。NDV昌黎株F蛋白裂解位点区(112~117aa)氨基酸序列为 R-R-Q-K-R-F,与强毒株在这一区域的序列(112R-R-Q-R/K-R-F117)相 符,证明NDV昌黎株是强毒株。 将克隆的NDV昌黎株部分F基因序列与四平株完整的F基因相应区域 进行置换,获得重组F基因,其长度为1754bp,含完整的开放读码框 (ORF),编码553个氨基酸。 用新型杆状病毒表达系统—Bac to Bac系统表达了重组F基因。首先 将重组F基因亚克隆入pFastBacⅠ质粒,构建了重组质粒pFrF。pFrF转化 大肠杆菌DH10Bac后,重组F基因在助手质粒(helper plasmid)帮助 下,通过转座进入Bacmid,构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X- gal/IPTG和三抗(庆大霉素、卡那霉素、四环素)的琼脂平板上挑选白色 菌落,提取re-Bacmid,转染sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内,re-Bacmid 经复制、表达、装配,形成了重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western blot 分析,重组蛋白获得表达,分子量约为63KD,表达的重组蛋白约占细胞总 蛋白的8.5%。 用表达的重组F蛋白免疫15日龄雏鸡,每只鸡约240μg,分别于免疫 后7、14、21天采血,分离血清,用间接ELISA测定抗体效价,并于免疫 后21天进行攻毒。结果表明,免疫的雏鸡体内可产生抗NDV抗体,能够抵 抗NDV强毒的攻击,保护率达80%。


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