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葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA介导的氟喹诺酮耐药性研究

于录  
【摘要】: NorA蛋白是葡萄球菌中最主要的一种跨膜多重药物外排蛋白,分子量为43kDa,介导了葡萄球菌对亲水性氟喹诺酮类药物及溴化乙锭、若丹明等多种结构上近似甚至无关的药物耐药。该蛋白由位于染色体上的norA基因编码,NorA蛋白的过度表达可显著引起葡萄球菌对氟喹诺酮类药物(FQs)的固有耐药性。本实验以人和动物的95株金黄色葡萄球菌和78株表皮葡萄球菌分离株及其中部分菌株的人工诱导耐药株、水杨酸钠诱耐药株、利血平消除耐药性株为研究对象,分四个实验对NorA蛋白及其编码基因norA进行了研究。 同时对人和动物(牛、猪、鸡)95株金黄色葡萄球菌和78株表皮葡萄球菌临床分离株的13种抗菌药物的多药耐药性、耐药谱进行了考查。耐药性检测结果表明,在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌临床分离株中,MRSA和MRSE所占的比例均已相当高,应引起高度重视。除万古霉素外,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌对其它类的抗菌药物均呈现多重耐药性,尤其以MRSA和MRSE为严重。试验菌株对4种氟喹诺酮类药物的耐药性检测结果表明,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌临床分离株的氟喹诺酮耐药性也很严重,且各氟喹诺酮药物间存在高度的交叉耐药性,但疏水性氟喹诺酮的抗菌作用较亲水性氟喹诺酮强,可能是NorA蛋白对亲水性氟喹诺酮的耐药起了作用,而对疏水性氟喹诺酮无外输作用或作用较小。 以外输泵抑制剂利血平为工具检测了临床分离葡萄球菌中NorA蛋白介导的氟喹诺酮外输情况,临床分离菌株中普遍存在着外输介导的氟喹诺酮耐药性。利血平的加入使三种亲水性氟喹诺酮的MIC降低幅度较大,而使疏水性氟喹诺酮MIC降低较小;个别菌株MIC未受到影响或有MIC增大现象,可能利血平在个别菌株中起到了NorA蛋白诱导剂的作用。考查了水杨酸钠和乙酸钠对葡萄球菌临床分离株的耐药性影响情况。水杨酸钠使部分临床分离金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮呈现耐药性增强现象,而乙酸钠无此作用。 成功地利用1/2MIC方法将敏感葡萄球菌诱导为耐药菌,证明葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性可以通过不断增加药物浓度梯度的方法诱导产生。 成功地将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌各10株的norA基因片段(1155bp) 克隆到pMD18*载体上。测序结果中除一株金黄色葡萄球菌的norA基因有两个氨 基酸的改变(但其MIC受利血平影响较小),另一株表皮葡萄球菌有单个碱基的变 化而无氨基酸变化外,其余菌株均无碱基改变。在多数由外输泵介导的氟睦诺酮耐 药葡萄球菌中,可能是非NorA蛋自编码区的基因发生了突变或其它原因致使NorA 必 蛋白的表达量增加而导致其耐药增强。 通过原核表达载体pET-28a(+)-norA的构建,成功地完成了norA基因(来源 于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的原核表达,用纯化的表达蛋白免疫家兔,获 取血清,通过间接ELISA法和Western七lotting检测结果表明,在国内首次制得NorA 的多克隆抗体。 利用制得的NofA多克隆抗体,通过 Western七lotting检测了 pET毛8a(+)worA 表达大肠杆菌 BLZI在 IPTG、水杨酸钠加 IPTG、利血平加 IPTG作用下NOrA i白 表达水平。结果表明,水杨酸钠和利血平的作用均增强了pETt8a卜)贝orA表达 大肠杆菌 BLZ中的 N。rA蛋白表达水平,说明水杨酸钠和利血平对表达大肠杆菌 BLZI中的 NorA蛋白表达都起到了诱导剂的作用。通过 Western七lotting检测了 6 株临床分离金黄色葡萄球菌(SAZI、SA35、SA47、SA52、SA76、SA92)、5株表 皮葡萄球菌(SE33、SE40、SE41、SE63、SE104)及标准菌株ATCC25923的NOrA 蛋白表达水平,氟喳诺酮类药物耐药水平较高的葡萄球菌菌株的N。rA蛋白表达水 平较高,敏感菌株的表达水平较低且较接近(个别菌株例外)。说明N。rAffi白介导 的氟睦诺酮外输对于葡萄球菌氟睦诺酮耐药性的产生具有重要作用,在一些临床分 离葡萄球菌菌株中,NorA外输蛋白对其氟喳诺酮耐药性起作用的同时,还有其它 耐药机制同时在起作用。对 3株人工诱导金黄色葡萄球菌(SA23、SA47和 AItU”乃)NOfA M曰的WCStCffi似OttlflR M测结果表明,历导团NOfA 堕HW符 异性条带的强度明显增大,N。rA蛋白表达水平有所提高。这说明,在人工诱导导 致金葡球菌耐药水平提高的机制中,NOrA蛋白表达水平提高是其主要机制之一。 在国内首次从norA mRNA的水平角度阐述了葡萄球菌对氟睦诺酮类药物的耐 药性。通过基因合成法构建了定量RT-PCR的内标准DNA,并通过定量RT-PCR检 测了上述 11株临床分离葡萄球菌和标准菌株的 norA mRNA水平。结果显示,同一 菌株的norA mRNA水平与实验二中检测的相应菌株的NorA蛋白的相对表达水平基 2 本一致。采用定量RT-PCR对照检测了人工诱导、水杨酸钠处理、利血平处理后的 一株金葡球菌?


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