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抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定

闫守庆  
【摘要】: 乙酰胆碱酯酶是一种丝氨酸水解酶,其主要的生物学功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱而终止神经冲动的传递。乙酰胆碱酯酶分子结构最显著的特点是在球形分子的表面有一向内凹陷的深2nm的谷,酶的活性位点位于谷的底部,主要由Ser200、His440和Glu327所组成的催化三联体构成;阴离子位点位于谷内,包括Trp84、Gly199和Tyr330三个氨基酸残基;外周阴离子位点位于峡谷的顶部,包括Try70、Tyr121、Trp279和Asp72四个氨基酸残基。 抗独特型抗体是由抗体可变区诱导产生的一类抗体,具有四种类型:Ab_2α、Ab_2β、Ab_2γ和Ab_2ε。其中Ab_2β类携带有抗原的内影像,在三维结构上与Ab_1所针对的抗原表位类似,因而能模拟外来抗原。根据独特型网络理论,如果能制备出针对天然酶活性中心的单克隆抗体,然后再以此单克隆抗体为抗原,制备Ab_2β类抗独特型抗体,它将能模拟天然酶的活性中心,因而具有与天然酶相似的生物学功能。 本研究采用B淋巴细胞杂交瘤技术,以人红细胞乙酰胆碱酯酶为抗原免疫BLAB/C小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,在用人红细胞乙酰胆碱酯酶为包被抗原间接ELISA筛选抗乙酰胆碱酯酶阳性克隆的同时,用兔抗人红细胞乙酰胆碱酯酶IgG筛选乙酰胆碱酯酶抗独特型抗体,最后获得6株抗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体,分别为11D4、12C3、13A4、13D8、13F6和14G5,而没有获得乙酰胆碱酯酶的抗独特型抗体。腹水采用辛酸—硫酸铵法纯化、SDS-PAGE鉴定,获得高纯度的单克隆抗体;经各株单克隆抗体对乙酰胆碱酯酶活性的影响以及乙酰胆碱酯酶活性位点和阴离子位点抑制剂对单克隆抗体与乙酰胆碱酯酶结合的影响实验,表明12C3和13F6对乙酰胆碱酯酶的活性具有一定的抑制作用,抑制率分别为35.24±4.39%和41.96±5.23%;而乙酰胆碱酯酶活性位点抑制剂及阴离子位点抑制剂对所有单克隆抗体与乙酰胆碱酯酶的结合均无抑制作用。说明单克隆抗体12C3和13F6虽然对酶的活性具有抑制作用,但所针对的抗原决定簇并不在酶的活性中心内。


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