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三倍体毛白杨遗传转化体系的建立及分子鉴定

石超  
【摘要】: 木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。然而纸浆生产主要是将原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离,该工艺过程产生了造纸工业的主要污染废液,并且增加造纸成本。本研究目的在于利用反义RNA技术,在分子水平调节木质素的生物合成,降低中国特有造纸树种三倍体毛白杨的木质素含量,培育更适于我国造纸工业的原料树种。而建立高效的遗传转化体系是利用植物基因工程改良三倍体毛白杨造纸性能的关键。本论文取得如下结果:(1)首次建立起三倍体毛白杨高效组织培养再生体系,得出以三倍体毛白杨叶片为外植体的最优分化培养基是MS+6-BA(0.25mg/L)+IBA(0.25mg/L)+ZT(0.25mg/L);以茎段为外植体的最优分化培养基是MS+IBA(0.25mg/L)+ZT(0.25mg/L)+TDZ(0.1μM)。(2)本实验优化三倍体毛白杨遗传转化体系并着重研究影响农杆菌转化效果的因素,得出EHA105是用于毛白杨遗传转化的适宜菌株;在共培培养基中加入200μM的乙酰丁香酮可以提高三倍体毛白杨的转化频率,由1.8%提高到7.0%;同时还发现共培培养基中去除微量元素的CoCl_22H_2O,转化频率由2.9%升高到6.0%。此外,本实验得出最佳菌液浓度为OD_(600)=0.3和浸菌时间为15-20分钟。(3)通过农杆菌介导法,将反义表达载体APCoA转化三倍体毛白杨。PCR,PCR-Southern检测证实,外源基因已整合到三倍体毛白杨基因组中。Northern点杂交结果表明外源基因已在转录水平表达。(4)本实验已获得大量转基因三倍体毛白杨,并已将42个转基因株系移栽至温室中成活,为CCoAOMT基因功能分析,筛选出木质素含量降低的三倍体毛白杨的工程植株奠定坚实基础。


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