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铜对仔猪关节软骨细胞增殖机理的研究

钱剑  
【摘要】: 软骨细胞的成骨作用是动物生长的重要条件,而软骨细胞增殖的状态,可作为铜促生长作用的重要指标。为了探明铜促进软骨细胞增殖的机理,本研究主要观测铜对软骨细胞外基质胶原、碱性磷酸酶以及生长因子基因表达的影响。 本试验以初生1日龄健康军牧1号仔猪为试验动物,分离、培养其股骨滑车缘关节软骨细胞。细胞培养液中分别添加0、15.6、31.2、62.5μmol/LCu,观察细胞形态,测定细胞培养液中碱性磷酸酶活性及细胞外基质胶原含量。利用Trizol法从关节软骨细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出IGF-Ⅰ cDNA、TGF-β cDNA,与PMD-18-T载体相连接,转化大肠杆菌JM109,通过PCR鉴定及测序分析,证明所扩增DNA片段为目的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,用β-actin作内参,用凝胶成像分析仪检测IGF-Ⅰ mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量。结果显示,细胞培养液中添加一定量的铜,软骨细胞培养液中碱性磷酸酶和细胞外基质胶原的含量显著提高,其中以31.2μmol/LCu浓度效果最明显。软骨细胞中IGF-Ⅰ mRNA、TGF-β mRNA的表达量均高于对照组(p<0.05),以31.2μmol/LCu组效果最为明显。据此推测,铜对软骨细胞的增殖作用是通过促进细胞IGF-Ⅰ mRNA、TGF-β mRNA的表达而实现的。


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