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结核分枝杆菌耐药基因检测及中草药作用的生物学变化

赵勇  
【摘要】: 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是结核病的病原菌。全世界 每年约有200余万人死于结核病。近年,由于耐药结核菌的出现,特别是多重耐药 结核菌的出现以及人类免疫缺陷病毒/艾滋病的流行,使这一全球性的疾病卷土重 来,其感染率、发病率和死亡率均居高不下。目前临床常用的一线抗结核药物主要 为INH、RFP、SM、PZA和EMB,但均已出现耐药菌,使得药物治疗效果不断下 降,而且耐药菌比例仍在不断上升。耐药结核菌使得临床治疗工作变得十分困难, 更增加了结核病的危险性,引起世界各国对结核菌耐药问题的极度重视。本实验在 对结核菌耐药性基因检测的基础上,筛选对耐药结核菌的耐药性有抑制作用或可增 强一线抗结核药物作用效果的中草药,为耐药结核菌的防治提供实验依据。 本实验通过BACTEC-TB460检测系统和MTT微量板法从临床分离出38株结核 菌,并确定分离菌株的耐药谱,从中筛选到17株耐利福平结核菌,9株耐链霉素结 核菌。根据结核菌耐利福平基因rpoB和耐链霉素基因rpsL的核酸序列设计合成引 物,对耐药基因进行PCR扩增、克隆及核酸序列测定,分析其耐药基因突变,检测 到3种耐利福平基因rpoB的突变,2种耐链霉素基因rpsL的突变,从分子水平确定 耐药产生的原因。 根据药性选择部分中草药通过煎煮、浸渍、蒸馏等方法制备成中草药粗提物。 采用MTT微量板法检测所制备中草药粗提物的敏感性对耐利福平、耐链霉素的结核 菌的最小抑菌浓度(MIC),结果大部分中草药粗提物高浓度可抑菌或杀菌,低浓度 无作用。将上述耐药菌在含药培养基上培养及传代,用MTT法检测其对RFP、SM 的耐药性,通过分析菌株耐药性的变化,确定中草药对菌株耐药性的影响,获得2 种中草药(黄连、百部)对细菌SM耐药性有抑制作用,同时还发现有5种中草药 可以不同程度增强链霉素的作用效果;但未发现中草药对耐RFP菌耐药性有抑制作 用。根据细菌耐药机制,对中草药抑制耐药性的作用机制进行分析,相对应地检测 了中草药作用作用前后上述耐药菌的菌体形态,菌体蛋白图谱和SM耐药基因rpsL 的耐药突变变化情况。结果表明,细菌菌体形态和菌体蛋白图谱无明显变化。SM耐 药基因rpsL序列发生突变,突变点有4处。


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