DNA启动子区甲基化状态改变在急性白血病微小残留病检测中的临床意义

【摘要】：随着对急性白血病(acute leukemia, AL)发病机制的深入研究及其治疗方案的改进,白血病的完全缓解率也有明显的提高,但是白血病的复发仍是目前治疗的难题,复发的根源是因为有微量的白血病细胞残留在体内。随着对急性白血病分子生物学发病机制研究的进步,人们把急性白血病的发生归结为抑癌基因和原癌基因通过遗传学和表观遗传学机制的发生异常改变。DNA甲基化作为一种表观遗传学改变在急性白血病中发生频率较高。多种抑癌基因启动子区由于高甲基化导致相应基因表达沉默,是急性白血病细胞的特征之一。特异基因或一组基因的甲基化可作为白血病细胞的分子标志物、治疗的靶点及判断预后的手段。 本研究中我们采用亚硫酸盐硫化测序方法(bisulfate sequencing)检测急性白血病不同进展时期骨髓标本ID4及ZO-1基因的甲基化状态,证实ID4及ZO-1基因在健康人中呈低甲基化状态,而在急性白血病中均呈甲基化状态,并且在完全缓解(complete remission, CR)时仍存在高甲基化的恶性克隆。在此基础上,我们建立荧光实时定量甲基化特异性PCR (quantitative methylation-specific PCR,Q-MSP)方法,对不同疾病状态的急性白血病患者骨髓标本进行ID4和ZO-1基因甲基化定量检测,此方法敏感性可达10-5。通过系列标本动态检测ID4和ZO-1基因甲基化水平变化,并分析其与临床病情发展的关系。 结果显示：1.通过实时定量甲基化特异性PCR检测ID4基因在9个白血病细胞系中均为阳性,ZO-1在7个甲基化水平细胞系中都为甲基化阳性；且淋系来源的细胞系甲基化水平高于髓系来源。2.甲基化特异性PCR检测健康人中ID4和ZO-1基因均为阴性；检测急性白血病骨髓标本,ID4和ZO-1基因甲基化率为72%和29%。ALL中ID4和ZO-1基因的甲基化阳性率和甲基化水平都高于AML。ID4甲基化在AML亚型间没有特异性。甲基化水平与已知遗传学指标变化趋势相一致,可作为泛白血病标志。3.不同疾病状态下(初治组、复发组和CR组)标本甲基化水平与临床病情密切相关。系列标本甲基化检测结果显示,甲基化水平与其相应的白血病肿瘤负荷有显著正相关性。且甲基化的情况不受性别、年龄、等临床参数的影响。4.同一白血病患者不同疾病时期甲基化水平与已知的遗传学检测指标变化趋势相一致,证实了甲基化水平作为急性白血病检测指标的真实可行性。5.CR期甲基化提前1-3月发现微小残留病,预测疾病疾病早期复发,具有白血病MRD检测标志的潜质。 总之,本研究成功建立了高敏感性和特异性的ID4、ZO-1甲基化特异性定量PCR的方法。通过临床样本首次证实ID4和ZO-1基因可能作为急性白血病的肿瘤标志。其启动子区的甲基化在各急性白血病亚型中具有覆盖率广；ID4和ZO-1基因异常的甲基化水平可以反应急性白血病患者肿瘤细胞负荷变化,提示其可能作为分子标志监测急性白血病的病情状态。