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基因修饰在提高脂肪来源干细胞移植治疗心梗疗效和指导体内示踪中的应用研究

杨俊杰  
【摘要】:急性心肌梗死严重危害人类健康,心肌细胞的不可再生和持续的心功能恶化导致其预后不良。近年来,干细胞移植治疗缺血性心脏疾病正受到普遍的关注。尽管如此,单纯的细胞治疗还有明显不足:首先,移植区域氧化应激及炎症损伤严重,移植细胞在病灶区注射后大量游走,移植细胞存活率和滞留率低;其次,干细胞旁分泌因子表达降低,心肌早期保护作用有限;最后,干细胞分化效果受到质疑,心肌远期保护能力弱。 近年来,基因修饰被用于提高干细胞移植治疗心梗的疗效。血红素氧合酶-1(HO-1)是一种血红素代谢的限速酶,参与的保护机制包括减轻内毒素、多种细胞炎症因子、金属等诱导的氧化应激损伤。其反应终产物CO、胆红素也被证实具有抗氧化、抗凋亡的作用。本研究通过转基因模式使自体脂肪来源干细胞(ADSCs)过表达HO-1,并评价其治疗心梗疗效。同时,基因修饰也为进一步研究干细胞移植后在活体内滞留和分化规律提供了可能。本研究随后利用融合标记报告基因技术在多种影像学手段介导下,实现对移植后的细胞体内示踪进行实时和多方位的结合,并评价其应用价值。 方法:本研究第一部分,在获得自体ADSCs的同时,向兔的心肌梗死区域分别注射过表达HO-1的ADSCs(HO-1-ADSCs组)、无基因修饰细胞(ADSCs组)和PBS液(对照组)。注射4周之后,测量心脏功能并从病理角度分析其治疗效果和分化潜能。本研究第二部分,使用优化技术将携带三标记融合报告基因的慢病毒载体高效转染感染ADSCs,该三标记报告基因可同时编码表达荧光素酶、单体红色荧光蛋白和短缩型胸腺嘧啶核苷激酶(fluc-mrfp-ttk)。转染后的ADSCs细胞系(TF-ADSCs)被用于细胞生物学性能等方面的评估。本研究第三部分,TF-ADSCs连同纤维蛋白胶支架载体联合移植入梗死心脏中,分别使用生物发光成像和小动物PET/CT成像技术明确ADSCs在体内的动态滞留规律,并使用组织学方法评估细胞在体内的分化潜能。 结果:1)超声心动图显示HO-1-ADSCs组心肌功能和左室结果均有明显改善。详细的组织学分析表明HO-1-ADSCs分化为心肌样细胞组织和管腔样器官结构。除了血管发生和梗死部位的改善外,相对于ADSCs处理组,在HO-1-ADSCs组可观察到更多的连接蛋白CX43阳性的缝隙连接和酪氨酸羟化酶阳性的心脏交感神经萌生。 2)融合报告基因病毒转染不影响细胞功能。体外成像分析显示细胞数量和生物发光信号(BLI)之间存在理想的线性相关(R2=0.99);同样,细胞数量和放射信号摄取也存在明确的线性相关(R2=0.98)。进一步体内分析显示,BLI技术和PET技术都可以观察到TF-ADSCs在心脏内的滞留,而且细胞能在移植部位完成向心肌再生和血管新生。同时,与BLI成像相比,PET/CT技术可以提供细胞滞留的准确定位。 结论:过表达HO-1的自体ADSCs移植治疗对于改善心肌梗死的预后是可行且有效的方法;同时,将影像技术的结合可以有助于可靠而又有效的检测移植细胞,在对可注射支架携带干细胞治疗心脏病的研究中具有重大意义。各种基于治疗或评价等相关基因病毒载体的成功构建,为采用基因治疗方法进行提高干细胞移植效率的研究奠定了良好的基础,也为明确干细胞移植后的体内滞留规律和远期分化潜能的研究,进而优化干细胞治疗提供积极的应用手段。


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