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隐性遗传性耳聋外显子测序技术基因鉴定及基因型与表型关联研究

赵飞帆  
【摘要】:遗传性耳聋严重影响人类学习交流和社会活动,是亟待解决的日益严重的健康问题。预防耳聋出生缺陷,提高人口素质是关系国计民生的重大问题,而预防的根本,就是深入了解遗传基因及其突变谱,发现中国人群的耳聋基因分布和热点突变,从而能够在人们的婚育指导上进行预测,提早进行预防。目前中国大部分聋人表现为隐性遗传性耳聋,而其中60-70%尚无法明确致聋基因。本研究利用了当前蓬勃发展的新一代测序技术,针对非综合征遗传性耳聋的隐性遗传小家系进行了病因研究,发现了在国际上发病率居2-3位的CDH23基因为负责基因,并发现了新突变。同时,在当前很多耳聋基因得到鉴定的背景下,本研究针对常见隐性遗传性耳聋基因GJB2和SLC26A4,对致聋基因型与临床表型进行了关联分析,在一定程度上阐释了基因型对表型的影响及对临床诊疗的指导意义。 第一部分利用外显子测序技术发现隐性遗传性耳聋致聋基因CDH23 一、外显子测序技术在3个隐性遗传性耳聋家系中的应用本研究选择了3个隐性遗传性耳聋的核心家系,家系中仅第三代有两例耳聋患者。首先进行了常见隐性耳聋基因和突变的筛查(GJB2、SLC26A4和线粒体DNA1555AG),未发现携带突变。然后,在784和845家系中,分别选择了两个患者和父母,在855家系中,因父亲亡故,选了两个患者和同胞弟弟,叔叔,及母亲,进行了全外显子测序。 测序结果的质控报告显示,测序深度达到50X,外显子长度达到3千万碱基左右,达到了人类全部外显子99%以上覆盖率。每个样本经过筛选,高可信度的数据如下:95000个左右的单核苷酸变异(SNP),2500个左右的剪接位点突变(splice site),7000左右的插入缺失突变(indel),58000左右的在外显子临近10bp以内的内含子突变(intron)。 根据目前已经公开的数据库进行了SNPs过库筛选分析,所采用的数据库包括dbSNP数据库、Hapmap-8数据库、1000Genomes、YanHuang (YH)。首先针对每个家系中每个样本的变异与各个数据库分别比对,筛选出所有数据库均没有报道的罕见变异;然后再把家系的正常人作为对照进行比对,根据疾病表型和基因型共分离的原理,筛选患者中纯合,而在父母或同胞杂合的变异,即得到候选基因的位点。对候选基因位点,选择在多物种间(大鼠、小鼠、狗、猴、鸡、象、X_嗜热病毒、斑马鱼)保守区域的5个碱基以内的插入缺失突变、剪接区、无义突变、经SIFT判定为具有蛋白质功能损害性的(damaging)的错义突变作为首选。 在784家系中,未发现符合上述条件的候选基因位点。在845家系中,发现了已知致聋基因CDH23的73553127位置发生的GA突变(c.6442GA,p.D2148N),是已在多个人种中报道过的致聋错义突变。在855家系中,发现已知致聋基因CDH23的73270943位置发生CT突变(c.403CT, p.Q135*),为终止突变,据多物种间序列保守性预测,可对蛋白质功能产生巨大影响。因此,845和855家系均是已知致聋基因CDH23突变导致的,其中c.6442GA为已知突变,c.403CT为新突变。 二、CDH23基因新突变验证及分子流行病学研究 855号样本经过眼科学检查,发现该患者伴发严重的视网膜色素变性,符合Usher1D综合征的诊断,CDH23基因正是该疾病的负责基因。在100例正常人群对照中,筛查c.403CT,未发现该突变。 本课题组收集到来自中国北方地区的108余例隐性遗传聋核心家系(包括855家系),进行常见隐性耳聋基因GJB2、SLC26A4的全测序研究,筛查了线粒体DNA A1555G,未发现携带已知突变。 鉴于CDH23基因为非综合征型遗传性耳聋(NSHL)较为常见的致病基因,经文献复习,查找到与NSHL中隐性耳聋DFNB12相关的CDH23基因29个突变,广泛分布于美国、德国、荷兰、日本、印度、巴基斯坦和阿尔及利亚等世界范围内的高加索人、非洲人和蒙古人种,人种间突变谱差异较大。利用Sequenom公司的基于质谱原理的MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统,在108个家系的患者中进行了CDH23基因与DFNB12相关的已知突变的筛查,并在855号样本中验证了新突变的存在。结果发现:3例单等位基因突变携带者,再结合外显子测序发现的1例纯合子,则CDH23基因在该样本中的NSHL相关等位基因突变率为2.31%(5/216)。 第二部分隐性遗传性耳聋患者中常见致聋基因GJB2和SLC26A4基因型与表型关联分析 一、295例GJB2双等位基因突变耳聋基因型表型分析 缝隙连接蛋白编码基因GJB2是非综合征型感音神经性耳聋(NSSHI)最常见的致病基因。该基因已有超过100种以上的突变被报道与耳聋相关,耳聋级别表现从轻中度到极重度均有覆盖。为评估中国人群中GJB2基因型对耳聋表型的影响,本研究在中国北方NSSHI人群中进行了横断面研究。 本研究纳入了295例携带GJB2双等位基因突变的中国北方七省的遗传性耳聋患者。以突变是否导致基因功能缺失将突变分为截短型(T)和非截短型(NT),将双等位基因型分为截短组(T+T),复合杂合截短组(T+NT),和非截短组(NT+NT)。每个基因型组的耳聋纯音测听平均听阈(PTA)进行了χ2卡方检验。发现截短组的耳聋程度显著超过非截短组。同时发现具有基因型c.[79GA;341AG]+[79GA;341AG]或c.[109GA]+[79GA;341AG]的患者其耳聋程度显著轻于c.235delC纯合子组,而具有c.[235delC]+[176_191del16]基因型的患者则显著重于c.235delC纯合子组。 二、272例儿童大前庭水管患者的基因型表型分析 本研究拟初步绘制儿童大前庭水管综合征患者的基因突变谱,并阐释其基因型对耳聋及内耳结构的影响。 12岁以下的272名大前庭水管综合征患儿纳入研究,进行了SLC26A4基因测序。其中266例接受了全套听力学检查,可获得平均听阈的数据,这其中,有152例患儿的高分辨率颞骨CT进行了详细测量。根据患者携带突变数量,分为双等位基因型,单等位基因型和无突变型,其中双等位基因型,再根据突变性质,分为双等位基因截短组,双等位基因复合杂合截短组,双等位基因非截短组。临床表型数据包括PTA,每个族群患者数量,前庭水管中段和外口直径等。 使用统计学软件SPSS15.0,将基因型数据和表型数据进行了关联分析,使用方法为计量资料t检验和计数资料卡方检验。 本组研究人群中,共发现SLC26A4基因的69种突变,其中2种为新突变(c.665GT和c.1639AG)。207例患者为双等位基因突变,56例为单等位基因突变,8例未发现突变,1例携带3个突变。经过统计学比较,发现单等位基因组的患者耳聋程度更为稳定(P0.05)。双等位基因非截短组的患者比双等位基因截短组,复合杂合截短组和单等位基因组更容易出现气骨导差(所有P值0.05)。 不同基因型组之间的前庭水管尺寸则没有明显差异(所有P值0.05)。不同前庭水管尺寸的患者之间耳聋严重程度也没有明显差异(所有P值0.05)。 本研究发现前庭导水管综合征的儿童中98%携带SLC26A4基因突变。虽然本研究发现了基因型与表型之间的一些关系,但是真正揭示基因型对表型的影响还有很远的距离。


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