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地黄低聚糖对同种异体脂肪组织来源干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死效应及机制的研究

裴志勇  
【摘要】:背景:尽管急性心肌梗死(AMI)的治疗取得了一定进步,但仍面临着诸多挑战。干细胞移植治疗AMI是一种很有潜力的方法,但缺血心肌局部恶劣的微环境严重阻碍了其疗效的发挥。 目的:评价地黄低聚糖(RGOs)对同种异体脂肪组织来源干细胞(ASCs)移植治疗小型猪AMI的疗效,探讨其可能的机制。 方法: 第一部分:热水法提取生地黄中的RGOs,经阳离子和阴离子交换树脂洗脱,活性炭柱层析纯化RGOs,以高效液相色谱法(HPLC)检测其水苏糖含量。 第二部分:酶消化法及贴壁法从小型猪腹股沟脂肪组织中分离、培养ASCs,流式细胞仪鉴定其分子表型;CCK-8法观察不同浓度RGOs对ASCs增殖的影响。 第三部分:人ASCs(hASCs)经RGOs(0.1mg/ml)预处理12h并继续干预,ELISA法观察不同时间点hASCs培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF),肝细胞生长因子(HGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),基质细胞衍生因子-lα(SDF-lα)浓度的变化。 第四部分:过氧化氢(200μM)联合血清饥饿(H2O2/SD,6h)模拟氧化应激微环境,诱导小型猪ASCs凋亡。观察RGOs(0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml)预处理12h并继续干预对ASCs凋亡的影响。AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡率,CCK-8法测定细胞活性,酶标仪比色法测定细胞caspase-3的活性,Western-blot法测定细胞Bax、Bcl-2的表达。 第五部分:17头小型猪随机分为4组:对照组(C组,n=5),单纯RGOs组(R组,n=4),单纯ASCs移植组(A组,n=4),RGOs+ASCs联合治疗组(RA组n=4)。球囊封堵左前降支90分钟构建小型猪AMI模型,造模1周后(7~10天)经冠状动脉移植同种异体ASCs(0.8×106/kg)。RGOs组造模前3天及造模后1月饲以RGOs粗提物(4g,2/日)。移植后8周,MRI评价各组心脏结构及功能变化,荧光显微镜及激光共聚焦扫描观察ASCs存活及分化,免疫组织化学法观察梗死区域微血管密度,Masson三色染色法评价梗死区纤维化程度,TUNEL法检测梗死边缘区心肌细胞凋亡,Western blot法测定梗死边缘区心肌细胞Bax、Bcl-2的表达。 结果: 第一部分:地黄粗提物及提纯物得率分别为地黄原药材的41.64%和35.14%,HPLC法检测RGOs提纯物中水苏糖占31.15%。 第二部分:成功从小型猪腹股沟脂肪组织中分离并培养了ASCs,第四代ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105呈阳性表达,而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈阴性表达。RGOs在一定浓度范围(0.01mg/ml~1mg/ml)内对体外培养的小型猪ASCs具有促增殖作用,最佳浓度为0.1mg/ml。 第三部分:RGOs(0.1mg/ml)可以促进体外培养的hASCs分泌VEGF、HGF、IGF-1、SDF-1α,但对于bFGF的分泌无明显影响,其促旁分泌作用具有一定的时效性。 第四部分:RGOs在一定浓度范围(0.1mg/ml~10mg/ml)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤,表现在细胞凋亡率下降,细胞活性增加,caspase-3活性降低,Bax表达下调,Bcl-2表达上调。 第五部分:与C组比较,仅RA组可以明显改善左心室功能,增加梗死区室壁厚度,减小左心室质量指数及梗死体积(p 0.05);RA组ASCs的存活多于A组(p 0.01);RA组梗死区域微血管密度明显高于其他3组(p 0.01),而3组间无显著差异;与C组比较,A组以及RA组均能明显降低梗死区纤维化程度(p 0.05,p 0.01);与C组比较,R组及RA组均能明显减少心肌细胞凋亡(p 0.05,p 0.01);与C组比较,三组Bax的表达均明显下降(p0.01),R组及RA组Bcl-2的表达明显升高(p 0.01)。 结论:RGOs可以提高ASCs移植的效率,其作用机制可能与RGOs改善缺血心肌局部的微环境,促进ASCs增殖、存活,增强ASCs的旁分泌功能及抗凋亡有关。


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