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吉西他滨原位凝胶注射剂抗胰腺癌作用研究

樊莉  
【摘要】:胰腺有内分泌和外分泌两种功能,也就有内分泌和外分泌两种细胞。这两种细胞都会发生癌变,来源自内分泌细胞的癌,叫神经内分泌癌(neuroendocrine tumor, NET),比较少见,多数情况下恶性程度比较低,病程比较长,治疗方式与常见的胰腺癌也有所不同。来自外分泌细胞的癌,就是我们常说的胰腺癌(pancreatic cancer, PC),是一种恶性程度比较高的肿瘤。至今已是世界第8位肿瘤致死因,欧美癌症致死的第4位死因,是恶性程度最高的肿瘤之一,其死亡率接近发病率。胰腺癌是一个高度恶性的疾病,约90%的病人无法以手术根除治疗。因此,胰腺癌的药物治疗在胰腺癌治疗中占有非常重要的地位。 传统的化学治疗对于胰腺癌的控制并无太大的帮助。过去常用的药物5-氟尿嘧啶(Fluorouracil,5-FU),但其反应率很少超过25%。目前,临床上治疗的主要手段仍然是在术后予以全身辅助的化学治疗,但目前用于PC的首选化疗药物吉西他滨(gemcitabine, GEM)也无突出新的显效率,且剂型单一,只有普通注射粉针剂(建议剂量是1000mg/m2),存在毒副作用大、靶向性差、用药顺应性差等缺点。 随着现代医学的发展,先进的医疗仪器和医疗诊断技术也在不断提高。超声内镜检查术(endoscopic ultrasonography, EUS)是一种在超声引导下的细针穿刺注射技术,能精准的找到癌组织,并利用内镜和超声相结合,将穿刺针有效的定位至胰腺癌新生血管等最易于药物发挥作用的部位,这为胰腺癌的瘤内注射治疗提供了有利的条件支持。 可注射性水凝胶因其独特的性质有望被广泛应用于药物释放等领域,用作多肽、蛋白质药物等生物活性物质的释放的载体。天然高分子可注射性水凝胶来源广泛,价廉易得;但由于材料来源不同,材料批次间差异明显,性能重复性差,结构与性能可调范围窄,且力学性能难以满足不同条件的医学需求。合成高分子可注射性水凝胶结构和性能可精细调控,重复性好,易于加工和工业化生产,尤其是降解性可控、具有良好生物相容性的聚酯/聚乙二醇聚合物水凝胶,颇具应用潜力。 本文采用聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA为材料,利用该材料的温敏成胶性质,即常温下成液体,遇生理温度快速变成凝胶的特性,于肿瘤局部注射,以期达到延长作用时间、提高药物肿瘤内浓度,同时使药物浓集在肿瘤部位并缓慢释药、达到安全有效的治疗目的。以吉西他滨(GEM)为模型药物,温度敏感型PLGA-PEG-PLGA聚合物为递药系统制备吉西他滨原位凝胶注射剂,并对其性质及体内外生物性能进行了考察。主要从以下几部分进行研究: 第一部分,以丙交脂(D, L-lactide, LA),乙交酯(glycolide, GA),PEG为原料,二乙基己酸亚锡为催化剂,在不同原料配比条件下,采用开环聚合的方式合成了三种不同比例的PLGA-PEG-PLGA聚合物,平均产率都在85%以上。对其结构、形态、分子量及多分散性、粒径、温敏特性、粘度-温度变化进行了考察。1H-NMR及傅立叶红外光谱表明其结构稳定,合成产物为目标产物。凝胶渗透色谱表明聚合物的分子量分布范围窄,无残留物质干扰,纯度较高。不同LA/GA比例的聚合物平均粒径分别为44.10±1.2nm、54.32±3.7nm、66.57±4.7nm,粒径分布相对均匀。采用试管倒置法测试相转变温度,结果表明所合成的嵌段聚合物在一定浓度时生理温度下均能产生凝胶,且溶液-凝胶转变温度Tsol-gel随LA/GA比例的增加而降低,同时也随聚合物浓度的增大而降低。温度粘度曲线也证实了聚合物从溶液向凝胶,从凝胶再向沉淀转变的粘度变化符合该状态下的粘度变化性质。 第二部分,对温度敏感性PLGA-PEG-PLGA聚合物拟作为医用材料的生物相容性和降解性进行了研究。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中考察了PLGA-PEG-PLGA聚合物的体外降解状态和性质变化,体外溶血的情况,体外细胞毒性;在裸鼠体内考察了PLGA-PEG-PLGA聚合物体内生物相容性。体外降解实验中,聚合物的体外降解时间接近一个月,通过GPC检测发现,聚合物的相对平均分子量逐渐降低,分子量分布逐渐变大。溶血实验表明,与对照组相比,不同量的聚合物的加入在观察的时间范围内无明显红细胞破裂或聚集的现象。采用CCK-8法测定细胞活性,聚合物对细胞增殖无明显影响,细胞活性在95%以上。裸鼠皮下注射的可立即形成凝胶,并保持其完整的形态超过3周,随着时间的延长凝胶体及逐渐变小直至消失,注射部位的肌肉组织没有明显的炎症反应。 第三部分,制备PLGA-PEG-PLGA吉西他滨原位凝胶,对制剂的表征、相转变温度及粘度性质进行了考察,建立了吉西他滨原位凝胶注射剂的含量测定方法。利用高效液相色谱法在20-500ug/mL范围内,线性良好,y=36387x+1.1E+5(R2=0.9996),方法的精密度,准确度符合要求。考察了吉西他滨原位凝胶注射剂的体外释放情况,该制剂可缓慢释放近20天。 第四部分,通过胰腺癌裸鼠移植瘤模型的建立,考察了吉西他滨原位凝胶注射剂的抗胰腺癌效果及体内安全性。考察了凝胶制剂致胰腺细胞凋亡作用,参比各种治疗因子,考察并评价了吉西他滨原位凝胶注射剂在体内的非特异性毒性情况以及对胰腺癌的治疗情况及生存率。裸鼠的血常规检测结果表明,吉西他滨原位凝胶注射剂毒性较小,与GEM市售注射制剂相比,PLGA-PEG-PLGA聚合物对GEM的包裹可以有效地减少与正常组织细胞对GEM的非特异性摄取,减小了GEM在体内的非特异性毒性。在裸鼠的体内治疗试验中,吉西他滨原位凝胶注射剂对胰腺癌具有明确疗效,对肿瘤的生长产生了明显抑制作用。 第五部分,建立了吉西他滨LC-MS/MS的分析方法,吉西他滨在1.5~15000ng/mL的范围内,线性关系良好。该方法的准确度,日内及日间精密度良好,均符合药典标准。吉西他滨的冻融稳定性和24小时稳定性良好。经过预处理的血浆和肝脏组织采用LC-MS/MS对其中吉西他滨的含量进行了测定,结果表明,吉西他滨凝胶给药组比普通吉西他滨注射剂在体内的滞留时间更长,减少了给药次数,存在一定的缓释效果。 综上所述,本课题成功合成了PLGA-PEG-PLGA聚合物,优化了合成条件,对聚合物的理化性质进行了表征,该聚合物在特定LA/GA比例和浓度时具有温度敏感的性质;体内外实验均表明,该聚合物在生理环境下可降解,具备良好的生物相容性。以温度敏感性PLGA-PEG-PLGA聚合物为基础,吉西他滨为模型药物,制备了吉西他滨原位凝胶注射剂,对制剂进行了理化性质表征考察,结果表明该制剂同样具有温度敏感的性质,同时建立了吉西他滨含量测定的方法,考察了制剂的体外释放情况。吉西他滨原位凝胶注射剂体内外实验表明,该制剂具有良好的肿瘤抑制活性,毒副作用较低,是一种安全有效的抗胰腺癌肿瘤制剂。通过研究可为胰腺癌和其他肿瘤化疗和生物治疗提供研究方法和思路,也可为今后靶向药物控释系统设计提供试验资料和理论依据。


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