少突胶质细胞在中枢神经发育与再生中的作用机制研究

【摘要】：中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）主要由两类细胞组成——神经元和胶质细胞。胶质细胞是神经系统的间质和支持细胞，对神经元的存活、分化、迁移、突触联系和神经冲动传导等均起到重要的调节作用，胶质细胞生物学已逐渐成为当前神经科学研究的热点之一。脑内的胶质细胞主要有三类：星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。本研究主要关注少突胶质细胞在中枢神经系统发育及损伤后修复中的相关作用机制。 少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs）由少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursor cells，OPCs）经过增殖、迁移、分化形成，是中枢神经系统唯一的成髓鞘细胞。在脊椎动物，神经系统中轴突髓鞘化的顺利完成以及髓鞘的完整性是维持轴突绝缘和实现动作电位跳跃式传导的重要保证，在进化上具有重要意义。在中枢神经系统发育及修复所涉及到的髓鞘化过程中，少突胶质细胞的迁移扮演了重要的角色。然而，精确调节少突胶质细胞迁移的细胞外和细胞内机制目前尚未研究清楚。近年来的研究显示，Slits蛋白家族可通过与其受体Robos的结合，调节诸多神经发育过程中的事件，例如细胞的迁移、粘附、轴突导向和延伸。Slit2在运动神经元区域具有高表达，而这一区域正是OPCs产生的区域；Slit2在大鼠腹侧脊髓维持高表达水平而在背侧脊髓低表达。这些空间表达特征提示，Slit2有可能参与了对OPCs迁移过程的调节，然而迄今尚未见Slit2在OPCs迁移中的作用的研究报道。 OLs通过形成髓鞘，促进神经冲动转导，并维持轴突完整性。神经损伤后，髓鞘崩解，并释放多种降解产物，能够抑制神经轴突的再生。这些降解产物被称为髓鞘相关抑制因子（myelin-associated inhibitory factors，MAIFs）。目前已鉴定出五个MAIFs，其中Nogo、髓鞘相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）以及少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）能够直接与同一个受体，Nogo受体复合物，结合并发挥功能。最初鉴定的Nogo受体复合物由三个部分组成：Nogo受体（NgR）、p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor，p75）和LINGO-1，之后的研究发现，TROY受体可以功能性地替代p75，参与组成Nogo受体复合物，即构成NgR/TROY/LINGO-1受体复合物。这一三联受体复合物与配体结合后，激活其下游的小G蛋白RhoA GTP酶，引起神经元生长锥塌陷、轴突再生抑制。目前已知神经突起生长的抑制依赖于TROY介导的RhoA激活，但TROY是通过何种机制激活其下游的RhoA，迄今尚不清楚。 本研究运用多种实验手段，对少突胶质前体细胞的迁移机制以及髓鞘相关抑制因子的作用机制进行了研究，旨在深入认识神经元与胶质细胞相互作用机制，以期为设计与开发促进神经再生与修复的策略开创新思路。本研究取得的主要结果如下： 1.轴突导向分子Slit2通过Fyn-RhoA信号通路调节少突胶质前体细胞的迁移 我们的研究显示：（1）运用免疫细胞化学、免疫组织化学、RT-PCR及Western-Blot实验方法，明确了在体外培养的以及体内OPCs中均表达Robos受体；（2）运用Transwell小室迁移实验，发现Slit2可以排斥OPCs的迁移，并且这种排斥效应与Slit2的浓度有关；（3）运用Robos受体的特异性抑制物RoboN进行Transwell小室迁移实验，可以显著减弱Slit2的这一效应；（4）用Slit2蛋白处理体外培养的OPCs，观察到OPCs中Fyn活化水平降低，而RhoA的活化水平升高；（5）运用免疫共沉淀实验（Co-IP）发现，OPCs中的Fyn可与Robo1相互作用，并且，对OPCs给予Slit2刺激后，Fyn和Robo1的结合强度下降。本部分结果表明，Slit2与其受体Robo1的结合能够通过Fyn和RhoA信号通路调节少突胶质前体细胞的迁移。 2. TROY受体与RhoGDIα的相互作用参与了Nogo-66介导的神经突起生长抑制作用 我们的研究显示：（1）利用GST（glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-转移酶）pull-down技术联合二维电泳、质谱分析，鉴定出RhoGDIα是TROY的一个结合分子；采用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在体外培养的细胞和组织水平进一步确证了TROY与RhoGDIα的结合；（2）缺失突变分析结果显示，TROY胞内段（ICD）的234-356aa（amino acids）和321-350aa两段序列介导了TROY与RhoGDIα的结合；（3）运用免疫细胞化学、免疫组织化学方法，在出生后的中枢神经系统的脊髓背根神经元（DRG）、大脑皮层神经元以及小脑颗粒神经元（cerebellar granule neurons，CGNs）中均检测到了TROY和RhoGDIα的共定位；（4）Nogo-66能够增强TROY/RhoGDIα的相互作用，且TROY/RhoGDIα的相互作用是p75非依赖性的；（5）在p75基因敲除小鼠的神经元中，TROY/RhoGDIα的相互作用仍然可介导RhoA的激活；（6）在野生型和p75敲除的小脑颗粒神经元中过表达RhoGDIα能够阻断Nogo-66介导的RhoA的激活以及随后的神经突起生长抑制。本部分结果表明，RhoGDIα与TROY的相互作用参与了Nogo-66介导的依赖于TROY的RhoA活化，并抑制了神经突起生长。 综上所述，本研究发现：Slit2作为一个轴突排斥性导向分子，能够在发育过程中以排斥性的方式调节OPCs的迁移；TROY作为髓鞘相关抑制因子受体的一个组成成分，可以通过与RhoGDIα的相互作用介导髓鞘相关抑制因子的神经突起抑制作用。这一研究有助于深入认识神经发育与再生过程中神经元与胶质细胞相互作用的机制。