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乙型肝炎病毒X基因亚型EHBH2在原发性肝癌进程中的作用及临床意义研究

徐庆国  
【摘要】:在消化系统疾病中,原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝脏疾病中严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤,其在全球的病死率排名第二。病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉毒素、饮用水污染及遗传因素等均是常见的诱癌因素。与欧美国家因饮酒过量导致的酒精性肝硬化是肝癌的主要病因不同的是,在我国由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)触发的慢性乙型肝炎和肝硬化是肝癌最主要的致病因素。据流行病学调查,在我国患有慢性乙型肝炎的患者约有1亿左右,而由HBV相关性疾病引起的死亡每年约有50万左右,因此深入研究HBV在肝癌发生、发展中的作用及机制对降低肝癌发生率和死亡率有着重要而深远的意义。HBV是嗜肝属不全双链环状DNA病毒,当其感染宿主后可在肝细胞内生长繁殖,同时激活免疫系统引起肝脏炎症反应,并通过基因片段整合和反式激活作用等多种复杂机制最终导致了肝癌的发生和发展。乙型肝炎病毒X基因(Hepatitis B Virus X Gene,HBx)是HBV四个开放阅读框中最小的非结构基因,由452-465个碱基组成,其直接参与HBV的感染、复制过程。研究证实HBx蛋白可通过广泛的反式激活作用调控宿主细胞多条信号传导通路,从而影响细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、细胞自噬和迁移能力等多种生物学过程。此外,多项全基因组测序数据显示HBV整合在宿主基因组上的片段约80%均是HBx片段,因此HBx还可通过由片段整合引起的基因组不稳定性、癌基因的激活、抑癌基因的失活等效应诱发肝癌。HBV的复制需进行反转录,在此过程中易发生DNA序列的变异。根据HBV的变异程度可将其分为8种亚型(A-H型)及不同的准种,这些不同HBV序列所携带的HBx DNA序列均不同。此外,HBx还可分为ayw, adr, adw, ayr四种不同的血清型。HBx序列本身也存在着点突变、C端截断突变和缺失突变三种突变形式。这些证据表明HBx DNA序列存在多态性。HBV多种亚型及HBx基因型均可影响HCC的发生和发展,表明HBx多态性在HCC的进程中可能存在重要的生物学功能。因此,系统的研究HBx多态性现象,进一步挖掘其可能的生物学作用及临床意义,可为HCC的防治提供新的证据和方向。第一部分HBV相关HCC患者HBx基因多态性分析及临床相关性研究目的:检测HBV相关HCC患者HBx基因的多态性并进行临床相关性分析,寻找具有临床意义的HBx亚型。方法:搜集多中心HBV相关HCC患者癌及癌旁组织、血清及临床资料,并对患者进行长期随访。抽提癌、癌旁组织及血清样本中基因组DNA,采用巢式PCR扩增HBx片段并进行测序。利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.05(MEGA6.05)和Cluster 3.0软件寻找差异位点并进行聚类分析。采用χ2检验、Kaplan-meier法、Log-rank检验统计分析各种多态性类型的临床意义。结果:1、HCC患者癌和癌旁组织中分别获得准确的HBx序列:287例患者癌中获得213条、癌旁中获得268条准确的HBx序列,癌旁中更容易获得HBx序列;2、癌组织中的HBx序列与癌旁中的不完全相同:其中癌和癌旁HBx完全相同占39%,不同的占61%,且不同的序列中差异位点较分散、无规律;3、癌和癌旁组织的HBx多态性大体可分为三型:我们将聚类分析显示的287例HCC队列中的HBx亚型分别命名为EHBH1、EHBH2和EHBH3;4、携带有HBx亚型EHBH2(以下简称HBx-EHBH2)的患者预后较好,且与多项临床指标相关:HCC患者(癌和癌旁)携带有HBx-EHBH2的总体生存率(OS)较高(癌,P=0.042;癌旁,P=0.041),且其在癌组织中HBx-EHBH2与肿瘤包膜相关(P=0.002),在癌旁组织中HBx-EHBH2与肝硬化(P=0.000)、TNM分期(P=0.033)、肿瘤包膜(P=0.010)、子灶(P=0.012)相关;5、验证队列证明HBx-EHBH2的存在并与患者预后相关:不同地区的HCC患者队列表明携带HBx-EHBH2的患者有预后较好的趋势;6,血清中HBx DNA序列与癌旁中的相同;7,血清中的HBx-EHBH2与患者预后相关:外周血中携带HBx-EHBH2的患者总体生存率较高(P=0.032)。结论:HCC患者癌和癌旁组织中HBx基因均存在多态性且不完全相同;HBx亚型EHBH2在HCC进程中有着重要的临床意义。第二部分HBx亚型EHBH2在人基因组整合的系统分析目的:研究HBx-EHBH2在人基因组整合的特点,对整合频率和位点进行相关分析。方法:利用HVID(High-throughput Viral Integration Detection)技术对癌和癌旁组织进行HBV插入片段的靶向捕获测序。针对HBV断点设计引物,通过PCR和Sanger测序验证整合位点。SPSS 18软件系统分析HBx-EHBH2与其它亚型在整合位点及频率等方面的差异。结果:1、HBX-EHBH2与其它亚型在总体整合频率(癌,P=0.52;癌旁,P=0.19),整合患者人数(癌,P=0.514;癌旁,P=0.228), TERT基因整合频率(癌,P=0.933), TERT基因整合患者数(癌,P=0.819),不同区域包括外显子(癌,P=0.782;癌旁,P=0.155)、内含子(癌,P=0.831;癌旁,P=0.095)、基因间区(癌,P=0.767)、启动子(癌,P=0.552癌旁,P=0.236)整合频率的比较,差异均无统计学意义;2、HBx-EHBH2与其它亚型的热点整合位点基因或附近基因不同:癌和癌旁组织中重复插入基因均不同;3、HBx-EHBH2插入基因的功能与其它亚型不同:GO分析表明两组整合位点基因或附近基因的功能不同。结论:HBx-EHBH2在人基因组的整合位点与其它亚型不同,且整合位点基因或附近基因的功能也不同,可能因此发挥了不同的生物学功能。第三部分HBx亚型EHBH2在HBV相关HCC中的作用机制研究目的:明确HBx亚型EHBH2的生物学功能,并初步探讨其可能的生物学机制。方法:全基因组合成HBx的5种序列,并构建质粒,合成慢病毒。转染肝癌细胞并构建相应稳转细胞系。CCK8和克隆形成实验检测各型HBx对细胞增殖的影响。流式细胞术检测各型稳转细胞系的细胞周期和凋亡。小鼠皮下荷瘤实验明确各型HBx在动物体内功能的不同。利用蛋白质结构预测软件对不同型HBx蛋白空间构象进行预测。基因表达谱芯片明确HBx-B和HBx-EHBH2对细胞表达谱的影响。结果:1、成功构建携带有5型HBx序列的稳转肝癌细胞株:稳转细胞株为携带有HBx-A、HBx-B、HBx-EHBH2、HBx-EHBH2A和HBx-EHBH2B的SMMC-7721和Huh7肝癌细胞株;2. HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A对细胞增殖能力的影响最弱:CCK8和克隆形成实验证明HBX-EHBH2和HBx-EHBH2A对细胞增殖的作用弱于HBx-A和HBx-B,而与NC组差异不明显;3、HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A对细胞周期的作用较弱:转染HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A的细胞S期所占比例低于HBx-A和HBx-B,而与NC组无明显差异;4、HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A对细胞凋亡的抑制作用较弱:HBx-EHBH2和HBx-EHBH2A早期凋亡率低于HBx-A和HBx-B,而与NC组无明显差异;5、HBx-EHBH2促进肿瘤生长的作用较弱:皮下荷瘤后肿瘤的生长速度慢于HBx-B,与NC组无明显差异;6、蛋白质结构预测表明:HBx-EHBH2的蛋白质结构与HBx-B不同;7、基因表达谱芯片分析结果显示:HBx-EHBH2调控的下游靶基因与HBx-B不同,并且两者的下游基因所富集的功能及信号通路不同。结论:HBx-EHBH2的生物学功能明显弱于其他类型HBx,并且主要通过HBx蛋白调控与其它亚型的下游靶基因,而发挥其生物学功能。


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