醛缩酶B在索拉非尼治疗肝癌的耐药作用研究

【摘要】：研究目的原发性肝细胞癌(以下简称,肝癌)是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率极高。肝癌病人门静脉癌栓((Portal vein tumour thrombus,以下简称PVTT)发生率很高,50%-60%的肝癌病人首诊时通过影像学检查就会发现有门静脉癌栓。PVTT可以导致肝癌病人门静脉压力升高、肝功能恶化、肝癌细胞肝内转移扩散等。因此研究肝癌伴门静脉癌栓发生的防治策略及早期诊断是临床提高肝癌病人整体疗效的当务之急。肝癌的治疗中索拉菲尼是当今世界公认的最为有效的药物,巴塞罗那分期中明确指出中晚期(BCLC:C)患者推荐使用索拉菲尼。但随着索拉菲尼的临床应用却发现临床耐的现象,既往以肿瘤干细胞、微环境等角度解释其耐药机制,但仍有很多局限。任何基因或状态的改变最终都会反映在代谢产物上。因而代谢组学是继蛋白组学与转录组学之后一门新兴学科,是组学的最终方向。也逐渐成为了肿瘤研究的热点。因此,本课题从肝癌门静脉癌栓患者(BCLC:C)使用索拉菲尼后收益效果更明显这一临床现象出发,通过代谢组学揭示其代谢重构规律,寻找引起代谢重构的关键基因,进而解释这一临床现象,为临床用药提供指导。研究方法1、通过对临床配对肝癌(非癌-原位癌-癌栓)组织原代培养,并利用13C稳定同位素示踪实验技术观察配对组织中代谢流量变化,揭示肝癌PVTT的发生发展中代谢重构特点。2、对比临床配对肝癌(非癌-原位癌-癌栓)组织的基因芯片筛选代谢相关基因,并通过Western blot蛋白免疫印迹和免疫组化实验验证。确定目的基因为ALDOB。3、构建p GFP-ALDOB嘌呤霉素抗性质粒通过慢病毒包装转染Huh-7、MHCC-LM3及CSQT-2肝癌细胞,并通过抗性筛选得到稳转细胞系。4、以过表达ALDOB的肝癌细胞系为基础,通过13C稳定同位素示踪实验技术观察ALDOB及Sorafenib对代谢重构的影响。5、以过表达ALDOB的肝癌细胞系为基础,利用CCK8实验研究ALDOB及Sorafenib对增殖能力;应用Transwell迁移、Transwell侵袭实验研究ALDOB及Sorafenib对细胞的侵袭转移能力等生物学功能的影响。6、购买部分免疫缺陷裸鼠,构建裸鼠皮下荷瘤模型观察ALDOB及Sorafenib对体内荷瘤能力;构建裸鼠尾静脉肺转移模型观察ALDOB及Sorafenib对体内转移能力。7、生物信息预测能与ALDOB相结合的靶蛋白。8、组织芯片免疫组化后分析ALDOB与G6PD在肝癌患者群体中的表达比例并利用卡方检验及Student`s Test检验分析ALDOB和G6PD的表达水平与临床病理特征相关指标关系。9、通过Kaplan-Meier和Log-rank分析ALDOB和G6PD的表达水平与临床预后的关系,包括:总体生存时间(Overall survival,OS)和无瘤生存时间(Disease free survival,DFS)。10、通过Log-rank单因素分析与预后相关的临床病理特征指标,并通过COX风险比例回归模型分析ALDOB与G6PD是否为肝癌患者预后的独立风险因素。结果1、临床配对肝癌(非癌-原位癌-癌栓)组织的代谢重构特点,结合临床配对肝癌(非癌-原位癌-癌栓)组织的基因芯片筛选及临床配对肝癌组织样本验证,发现在肝癌的发生发展(非癌-原位癌-癌栓)过程中ALDOB逐渐下降2、ALDOB过表达及应用Sorafenib对肝癌细胞的代谢水平发生了明显的变化,提示:ALDOB是肝癌发生发展中调节糖代谢重构的关键基因。ALDOB对Sorafenib用药前后代谢改变趋势相反。3、ALDOB过表达可抑制肝癌细胞的增殖。再次基础上应用Sorafenib,下降了药物对肿瘤的抑制效果。提示;ALDOB是肝癌发生发展中的关键基因。ALDOB下降了Sorafenib对肿瘤细胞的抑制作用。4、ALDOB抑制了Sorafenib对肿瘤细胞线粒体膜电位的下调。5、ALDOB减少了Sorafenib对肿瘤细胞产生ROS的抑制作用。6、ALDOB的表达水平与肿瘤大小、肿瘤包膜、癌巢内癌栓和细胞病理分级等临床病理特征相关;G6PD的表达水平与细胞病理分级和复发等临床病理特征相关,提示:ALDOB与G6PD在肝癌的发生发展过程中起到重要作用。7、ALDOB与G6PD的表达水平与肝癌患者的预后密切相关,ALDOB低表达组患者总体生存时间(OS)、无瘤生存期(DFS)明显低于ALDOB高表达组;G6PD高表达组患者总体生存时间(OS)、无瘤生存期(DFS)明显低于G6PD低表达组。进一步因素分析,ALDOB为肝癌患者预后的独立风险因素。结论ALDOB参与肝癌发生发展中的糖代谢网络重构;同时参与调控肝癌细胞的增殖;ALDOB可降低Sorafenib对肿瘤细胞的抑制作用;ALDOB抑制了Sorafenib对肿瘤细胞线粒体膜电位的下调。ALDOB减少了Sorafenib对肿瘤细胞产生ROS的抑制作用。在临床组织中ALDOB低表达;G6PD高表达;ALDOB与G6PD的表达水平与肝癌患者的临床病理特征密切相关;ALDOB与G6PD的表达水平与肝癌患者的预后密切相关,ALDOB是肝癌患者预后的独立风险因素。ALDOB高表达的肝癌患者不适宜使用Sorafenib。ALDOB与G6PD的表达水平相结合可更好的预测肝癌患者预后。研究结果提示:ALDOB与G6PD可作为肝癌的预后指标及干预靶点。