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宫颈癌放疗前后干性相关基因差异表达及意义

傅志超  
【摘要】:放射治疗是肿瘤治疗的三大重要手段之一,大约有60-70%的肿瘤患者在治疗的不同阶段需要进行放射治疗,世界卫生组织在1992年报告,45%的恶性肿瘤可以治愈,其中,手术贡献22%、放疗贡献18%、化疗5%,充分体现放射治疗在肿瘤治疗中的地位。随着适形放疗、调强放疗及影像引导调强放疗(IGRT)等精确放疗设备的广泛应用,以及质子、重离子等新型电离射线在临床的不断应用,放射治疗在肿瘤治疗的作用进一步得到提高。但在临床放疗实践中,广大放疗工作者也观察到部分患者在治疗中,并没有取得良好的治疗效果,或者是初始放射治疗中,肿瘤得到良好的控制,获得明显的影像及临床疗效,但就是在很短的时间内,患者肿瘤又出现局部复发或远处转移,而且肿瘤的再程治疗往往非常困难,效果不佳,最终影响肿瘤放疗的最终疗效。肿瘤复发与转移成为临床工作的难点,其机制的研究成为临床与基础研究的热点。目前,肿瘤生物学研究认为,恶性肿瘤转移与复发的重要原因是由于肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞的重要特征之一是放化疗抵抗,其中,肿瘤干细胞特殊的基因表达谱及分子生物学功能是其特异生物学行为的重要原因,这些特殊相关基因被称为干性相关基因,这些干性相关基因的辐射抵抗机制是肿瘤放射生物学的重要内容。参与辐射抵抗作用的干性相关基因有哪些,这些干性相关基因的作用机制如何目前仍不清楚。本研究拟通过根治性放疗宫颈癌为研究对象,应用基因表达谱芯片技术筛选出放疗抵抗干性相关基因,并对感兴趣干性相关基因进行相关辐射抵抗分子机制研究以及临床预后确证。一方面将为临床肿瘤放疗患者预后疗效判断提供重要参考指标,为临床个体化放疗提供依据,另一方面通过对相关分子靶点的研究,将能寻找到临床提高放疗疗效的有效手段,为提高肿瘤放疗疗效指出有效的治疗措施。研究方法1、选取放疗至50Gy时肿瘤仍明显残留的根治性放疗宫颈癌患者3例,分别获取放疗50Gy仍残留及放疗前的肿瘤组织,通过基因表达谱芯片筛选出放疗前后差异表达基因。2、应用荧光定量PCR对部分基因进行验证以保证芯片结果的可靠性并筛选出感兴趣干性相关基因CXCL12与CD44。3、通过免疫组化方法检测130例根治性放疗宫颈癌患者的CXCL12和CD44的表达,分析其表达的临床预后判断价值。4、设计3条CXCL12的siRNA序列转染Hela宫颈癌细胞,抑制Hela细胞CXCL12-2-的表达,elisa法、实时荧光定量rt-pcr检测cxcl12表达变化,并通过流式细胞仪检测对cd44和cxcr4表达的影响。5、应用sirna方法抑制hela细胞cxcl12的表达结合不同剂量照射,应用cck8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪pi双染法检测细胞凋亡率,,elisa法、实时荧光定量rt-pcr检测cxcl12表达变化,并通过流式细胞仪检测对cd44和cxcr4的影响。研究结果1、基因表达谱芯片结果发现,上调表达3倍以上的基因有111个,下调表达3倍以上基因有127个,其中cxcl12表达上调34.37倍,cd44表达上调3.40倍,荧光定量pcr证实芯片结果可靠。2、免疫组化结果显示,cxcl12阳性表达主要定位于肿瘤细胞膜和细胞质,cd44阳性表达主要定位于细胞膜,在根治性宫颈癌中,cxcl12或cd44的表达与患者年龄、figo分期、淋巴结转移、肿瘤分型、肿瘤大小、治疗方案情况无明显相关性;log-rank生存分析及多因素生存分析均发现:宫颈癌figo分期、淋巴结转移、cxcl12表达、cxcl12和cd44共表达是独立的生存预后因素,log-rank生存分析cd44是预后的影响因素,但多因素分析cd44未有统计学差异。在130例宫颈癌患者中,cxcl12和cd44表达具有显著相关性(p=0.028);cxcl12表达阴性的5年生存率为50.6%,阳性的仅为30.0%,cd44表达阴性的5年生存率为42.3%,阳性的仅为33.4%,其有34例患者存在cxcl12和cd44共表达,通过生存生析,这34例宫颈癌患者的5年生存率显著降低,仅为22.9%,剩余患者的5年生存率为44.5%(p=0.005)。3、通过荧光定量rt-pcr检测cxcl12mrna,结果显示si-rna1、si-rna2、si-rna3的mrna相关表达量分别为0.69±0.16、0.27±0.05、0.50±0.12。elisa检测cxcl12蛋白表达的影响,cxcl12蛋白相对表达量分别为:si-rna1(0.62±0.04)、si-rna2(0.33±0.04)、si-rna3(0.52±0.05),无论是mrna还是蛋白表达,si-rna2抑制效果最明显(p0.05)。4、si-rna2转染hela细胞48h后,利用流式细胞仪分别检测cd44和cxcr4蛋白表达变化,结果显示,见图2,si-rna组cd44蛋白表达量为0.69±0.01,明显小于空白对照组(1.00±0.02)及阴性对照组(1.02±0.03)。si-rna组cxcr4蛋白表达量为1.41±0.08,明显小于空白对照组(1.00±0.01)及阴性对照组(0.96±0.03)。5、与单纯照射组相比,沉默cxcl12联合照射抑制hela细胞的增殖的同时,促进细胞的凋亡。cck8法:细胞存活率从单纯4gy照射的79%降低到62%,从单纯8gy照射的59%下降至44%。流式细胞仪的annexin-v/pi双染法:单纯4gy照射的细胞凋亡率为21%升高至SiRNA+4Gy的凋亡率为27.96%,单纯8Gy照射的细胞凋亡率为39%升高至SiRNA+8Gy的51%。6、与单纯照射组,沉默CXCL12联合照射可抑制Hela细胞CD44的蛋白表达,促使CXCR4的蛋白表达。流式细胞仪分别检测蛋白表达,结果显示:4Gy照射组中,单纯照射组的CD44蛋白表达量(1.55±0.02)下降至Si RNA组的1.33±0.02,而单纯照射组的CXCR4蛋白表达量(1.13±0.02)上升至Si RNA组(1.40±0.01);8Gy照射组中,单纯照射组的CD44蛋白表达量((1.85±0.02)下降至Si RNA组的1.40±0.01。单纯照射组的CXCR4蛋白表达量(1.27±0.02)上升至Si RNA组(1.48±0.02)。结论1、表达谱芯片筛选到与宫颈癌放疗抵抗相关基因238个,其中上调基因有111个,下调基因有127个;干性相关基因CXCL12表达上调34.37倍,CD44表达上调3.40倍。2、CXCL12与CD44在宫颈癌中表达具有相关性,CXCL4和CD44是根治性放疗宫颈癌患者的重要预后不良因素。3、沉默CXCL12可通过阻止细胞增殖、促进细胞凋亡来增加宫颈癌细胞的辐射敏感性。4、CXCL12至少部分通过介导CD44阳性宫颈癌干细胞微环境来促进放疗抵抗。


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