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细胞周期因子FoxM1促进肝脏再殖的研究

向导  
【摘要】:近二十年来,临床上一直致力于开展肝细胞移植技术的研究。作为原位肝移植(orthotopic liver transplantation)的替代方案,肝细胞移植技术研究取得了一定成效。然而,由于移植的肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢,存活时间有限,并且随宿主自身肝细胞的更新而减少,治疗性肝脏再殖(therapeutic liver repopulation)仍难以实现。建立有效的肝细胞治疗方案仍然存在很大的困难,是目前肝细胞移植技术发展的瓶颈问题之一。肝脏再殖是移植的外源细胞及其所增殖的子代细胞参与受损肝脏结构的修复,并正常地发挥肝细胞生理功能的现象。外源供体细胞能够留存于受体肝脏内并在数量与功能上具有治疗意义的基本前提是移植的供体细胞要比内源肝细胞具有更强的生长或生存优势。基于现有的认识,这一前提可以通过两种策略来实现:一是抑制受体中内源肝细胞的增殖。例如,采用倒千里光碱等化学物质抑制受体肝细胞的增殖,以及应用受体肝细胞具有遗传性缺陷的uPA小鼠或Fah基因剔除小鼠模型等。然而,以上模型都是通过诱发自身肝细胞的死亡从而获得适于移植肝细胞增殖的肝脏微环境,这些方法尽管作为研究肝脏再殖的模型能够在动物中实现,然而在临床应用中却是不可行的。二是增强移植肝细胞在受体肝脏中的生长或生存优势。这种新策略的基本思路是通过调节移植肝细胞中细胞周期因子的表达,促进其内在的增殖能力,增强移植肝细胞对损伤肝脏的再殖能力。因此,如何选择有效的细胞周期调控因子是目前该领域的关键问题;其次,利用什么样的载体和方式稳定、有效地调控肝细胞相关细胞周期因子的表达也是目前面临的重要问题;同时,上调细胞周期因子是否会带来成瘤风险等问题是必须考虑的安全性问题。本研究探讨并尝试解决这些重要科学问题。Fox转录因子超家族成员FoxMl作为细胞周期G1/S和G2/M进程的关键调节因子,是负责启动细胞增殖的必需基因。研究发现,FoxM1可以调控G1/S进程中必需蛋白质如Skp2、Cks1、p21、p27和Cdc25A的表达,同时也可调控有丝分裂相关蛋白如Cyclin B、Cdc25B、Survivin、Aurora B激酶、Polo-like激酶1、CENP-A、 CENP-B和CENP-F的表达。此外,提高FoxMl的表达能降低细胞周期抑制因子p27的表达水平,从而增加细胞周期激动剂如Cdc25B的水平,进而促进肝脏再生。进行部分肝切后,以生长激素处理来诱导高龄小鼠的FoxM1表达,可恢复其正常的肝再生能力,而通过腺病毒载体介导FoxM1的瞬时表达也可达到相同的效果。FoxM1过表达的小鼠部分肝切后,持续表达FoxM1的肝细胞与野生型肝细胞相比,至少提前8小时进入S期,这种增殖优势与DNA复制及有丝分裂必需基因的提前激活有关。在部分肝切诱导的小鼠肝再生过程中,FoxM1失活可降低肝细胞DNA的复制水平、阻滞细胞的有丝分裂。更重要的是,肝甲状腺素结合蛋白启动子(TTR)调控FoxM1在肝组织中的长期表达并不导致自发性肝细胞癌的产生;以二甲基硝胺/苯巴比妥(DEN/PB)作为肝细胞癌发生的诱导剂,肝脏持续表达FoxM1的小鼠与野生型小鼠相比,其肝癌发生率及程度并无差别。这都表明TTR-FoxM1转基因小鼠肝细胞中FoxM1的稳定表达并不会导致肝细胞癌的发生。基于以上关于"FoxMl可以促进肝细胞增殖而不会诱发肿瘤”的发现,我们推测FoxM1可能是一个可以用于提高外源肝细胞在损伤肝脏中再殖水平的细胞周期因子。因此,本研究选择FoxMl作为本研究的目的基因,通过在移植肝细胞中过表达FoxM1基因,探讨其促进肝细胞肝脏再殖能力的作用。为探讨活体内持续表达FoxMl的肝细胞是否可以增强肝脏再殖的能力,我们首先采用TTR-FoxM1转基因小鼠模型,获得FoxM1持续表达的肝细胞,进行肝脏再殖能力的检测。然后,将相同数量的TTR-FoxM1肝细胞和野生型肝细胞分别移植,或通过竞争性再殖实验混合移植,进入检验肝脏再殖的理想模型——FAH基因剔除小鼠(Fah-/-小鼠),在不同时间点分析两种细胞肝脏再殖的效率。结果显示,FoxM1持续表达的TTR-FoxM1肝细胞在相同时间点完成的再殖程度更高,再殖损伤肝脏的能力比野生型肝细胞提高了1.5倍,并且比野生型肝细胞提前2周完成肝再殖。同时,我们将相同数量的TTR-FoxM1肝细胞和野生型肝细胞移植到2/3肝切的小鼠模型中,在急性肝损伤模型中评价肝脏再殖能力。结果显示,表达FoxM1的TTR-FoxM1肝细胞的肝脏再殖效率为5%-9%,而野生型肝细胞的再殖效率不超过2%。这些结果表明,活体内FoxM1过表达的肝细胞具有更强的生长和生存优势。基于FoxM1的高表达可以提高肝细胞在活体内再殖肝脏能力的特性,我们进一步探讨了如何赋予肝细胞FoxM1高表达特性的技术策略。通过DNA运载系统载体改造野生型肝细胞,从而获得FoxM1持续表达的肝细胞,这是开展临床应用的必经途径。因此,本研究引入能整合基因组并能长期稳定表达目的基因的非病毒载体一—Sleeping Beauty (SB)转座子系统,构建了FoxM1 SB载体。在前期工作中,基于Fah-/-小鼠的肝脏再殖特性,我们建立了应用SB载体同时将多个基因导入肝实质细胞的技术体系。根据前期工作的经验基础,我们采用液体压力法将FoxM1 SB载体注射至Fah-/-小鼠尾静脉,对注射后获得的FoxM1稳定表达的肝细胞进行增殖能力和肝脏再殖能力的分析,从而评价SB转座子系统传递FoxM1基因修饰肝细胞的有效性及稳定表达FoxM1肝细胞的增殖能力。我们的研究结果发现,SB载体介导的FoxM1稳定表达(SB-FoxM1)的肝细胞与野生型肝细胞相比,在相同时间内肝脏再殖程度更高,与前一部分TTR-FoxM1转基因小鼠模型的结果相似。通过活体生物荧光成像技术,我们证明了SB-FoxM1稳定表达的肝细胞比野生型肝细胞提前2周完成肝再殖。同样,将SB-FoxM1稳定表达的肝细胞移植到2/3肝切急性肝损伤小鼠模型中,能够实现4%-9%(最高15%)的肝脏再殖。在体外实验中,体外培养的SB-FoxM1肝细胞比野生型肝细胞具有更高BrdU掺入阳性细胞比例。此外,我们还检测了两种细胞中Ki67和PCNA表达,发现SB-FoxM1肝细胞具有增强的增殖活性。以上实验结果表明,应用SB载体可有效地传递FoxM1基因,稳定表达FoxM1的肝细胞的增殖能力增强,在慢性和急性肝损伤模型小鼠中再殖损伤肝脏的能力都较野生型肝细胞有显著地提升。同时,我们通过直接体外转染新鲜分离的肝细胞,获得表达FoxM1的肝细胞,并对其进行肝脏再殖能力的检测与分析。通过再殖实验,我们证明了直接体外转染FoxM1质粒的肝细胞也具有更强的肝脏再殖能力。这种体外修饰成熟肝脏细胞,从而使其获得更强的肝脏再殖能力的方法具有更大的临床应用价值。上调细胞周期因子是否会引起组织的异常增生甚至诱发肿瘤,这是必须考虑的安全性问题。我们通过病理学检查发现,持续表达FoxM1细胞移植后再殖的受体肝脏形态结构正常;通过贯序移植及在体长时间观测实验都没有发现肿瘤的发生;通过激光捕获显微切割技术获取FoxM1表达肝细胞移植后重建的受体肝脏组织,进一步检测肿瘤相关基因表达,发现在肝细胞中过表达FoxM1没有诱发肿瘤形成。这些证据表明,利用非病毒SB载体调控FoxM1表达的方式可以安全地应用于增强肝细胞增殖能力的研究中。综上所述,本研究证明了细胞周期调节因子FoxM1具有增强肝细胞增殖能力和促进肝脏再殖的作用。作为本研究的创新点,我们首次利用非病毒载体传递FoxM1基因的技术体系,避免了病毒载体所带来的内源性病毒重组、插入激活和免疫反应强等不安全因素,这在一定程度上增加了在人类肝脏疾病细胞治疗中的实用性。此外,本研究还证明了通过遗传修饰使FoxM1高表达的肝细胞不会诱发肿瘤。本研究的开展,为解决移植肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢的问题提供了一个新的思路。


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