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Gankyrin正反馈调控Nrf2在肝细胞癌中发挥抗氧化作用

杨纯  
【摘要】:肝癌是临床常见肿瘤之一,在我国患者的平均年龄为44岁。肝癌化疗效果差、高复发、高转移、预后差,在恶性肿瘤中肝癌死亡率城市统计占第三位,农村则占第二位。近年来转化医学迅猛发展,针对特定癌基因的靶向性治疗方法被认为是最具发展潜力的肝癌治疗手段。目前,肝癌发病机制、靶向治疗基因和有效治疗方法是目前的重要研究方向。ROS的对细胞具有双重作用,适宜浓度的ROS的存在对细胞的正常生理活动非常必要,ROS能够作为信号分子参与细胞增殖、细胞周期及受损的细胞器清除等过程。然而,高浓度的ROS能够与影响细胞内多种生物大分子(脂类、DNA及蛋白质)的稳定性进而导致细胞损伤。生理情况下,ROS水平由一个程序性诱导的抗氧化系统严格控制使其维持较低的浓度,发挥其正常生理功能而不会损伤细胞。机体内的ROS水平升高与人类的衰老及多种疾病如肿瘤、神经退行性疾病、炎症以及心脑血管疾病等的发生均有密切联系。ROS在肿瘤的发生发展、转移和侵袭过程中均有重要作用。NF-E2相关因子2(Nrf2)是调控细胞防御氧化应激和亲电子物质刺激的核心转录因子。Nrf2能够通过上调一系列抗氧化酶基因及解毒酶等基因的表达从而维持细胞内的氧化还原稳态。Nrf2在肿瘤的发生发展过程中也具有双重作用,一方面,KEAP1-NRF2-ARE途径介导的抗氧化反应能够保护细胞免受外界刺激导致的损伤,尤其是DNA损伤,因此具有一定的抗癌作用;另一方面,在多种肿瘤中均发现了Nrf2高表达,并且Nrf2与肿瘤细胞耐药性密切相关。Gankyrin是人类26S蛋白酶体的一个非ATP酶调节亚基,2000年Fujita等从人类肝癌组织高表达的基因中筛选得到,其蛋白质结构包括五个ankyrin重复序列以及N端和C端各半个ankyrin序列。在肝癌早期就能检测到gankyrin表达水平升高。Gabkyrin与HCC患者的年龄、性别、HBV或HCV感染,肿瘤大小及肿瘤细胞分化程度均无相关性,但与HCC的高转移性相关。Gankyrin能够影响肝细胞癌的侵袭和转移(调控PI3K/AKT/HIF-1α信号通路),维持HCC肿瘤起始细胞的功能(抑制Wwp2对Oct4的降解激活)并影响HCC细胞的去分化(上调HNF-4α),这些研究结果都证明Gankyrin在肝癌的发生发展过程中起重要作用。本研究主要目的是研究gankyrin在肝癌细胞对抗氧化应激中的作用,gankyrin与Nrf2抗氧化反应体系的相互作用及其在肝细胞癌发生发展中的作用。实验方法:1.运用RealTime-PCR、Luciferase荧光素酶报告基因系统,western blot等方法检测H2O2检测对gankyrin基因表达水平的影响;2.应用流式细胞仪,荧光显微镜检测gankyrin对肝癌细胞内ROS水平的影响;3.利用电镜,荧光显微镜及线粒体氧消耗试剂盒检测gankyrin对于肝癌细胞线粒体结构及功能的影响;4.应用流式细胞仪,荧光显微镜检测gankyrin对肝癌细胞内氧化应激状态下细胞死亡水平的影响;5.通过quantitative Realtime PCR,western blot,细胞总抗氧化能力检测试剂盒和Luciferase荧光素酶报告基因系统检测gankyrin对细胞内抗氧化酶基因的调控水平;6.应用western blot检测gankyrin对细胞内Nrf2表达水平的调控作用;7.应用蛋白质免疫共沉淀技术和western blot检测gankyrin对细胞内Nrf2泛素化水平的调控作用;8.应用蛋白质免疫共沉淀技术和western blot检测gankyrin与Keap1的相互作用;9.应用染色质免疫共沉淀(ch IP)、q RT-PCR及western blot检测Nrf2对于gankyrin的转录调控作用;10.应用免疫组织化学、大鼠DEN诱癌模型及裸鼠皮下荷瘤实验中检测肿瘤发生发展过程中gankyrin与Nrf2的协同作用;11.利用免疫组化、组织芯片检测人类肝癌组织中gankyrin与Nrf2的协同作用与肝癌预后的关系。结果:1.H2O2刺激能够诱导gankyrin表达;2.Gankyrin能够降低肝癌细胞内的ROS水平;3.Gankyrin能够稳定肝癌细胞内线粒体的结构和功能;4.Gankyrin能够保护肝癌细胞免受氧化应激导致的细胞死亡;5.Gankyrin能够促进肝癌细胞内抗氧化酶基因的表达;6.Gankyrin能够抑制Nrf2泛素化并稳定肝癌细胞内Nrf2的蛋白水平;7.Gankyrin能够与Nrf2竞争性结合Keap1的Kelch结构域并抑制Keap1与Nrf2结合;8.Nrf2能够通过gankyrin启动子区的ARE元件促进gankyrin转录;9.Gankyrin与Nrf2协同作用稳定肝癌细胞内线粒体的结构和功能;10.Gankyrin与Nrf2协同作用保护肝癌细胞免受氧化应激导致的细胞死亡;11.在大鼠DEN诱癌模型中,gankyrin与Nrf2的累积伴随发生;12.人类组织芯片中,Nrf2与gankyrin表达存在相关性,并且二者的表达水平与患者预后密切相关;结论:本研究主要发现在肝癌组织中gankyrin与Nrf2之间存在正反馈调节,gankyrin可以竞争性结合Keap1蛋白的Kelch结构域,抑制Nrf2与Keap1结合并通过蛋白酶体途径降解,稳定Nrf2的表达;而Nrf2则能够通过结合gankyrin启动子区的ARE元件促进gankyrin的表达。Gankyrin-Nrf2正反馈协同作用诱导下游抗氧化酶靶基因的转录,维持肝癌细胞内的氧化还原稳态,保护细胞免受氧化应激所导致的线粒体损伤和细胞死亡。在大鼠DEN诱癌模型中,Gankyrin与Nrf2随着肝细胞癌发生发展过程中在癌巢组织中相互伴随累积。Gankyrin与Nrf2在人类HCC组织中也存在相关性,Gankyrin与Nrf2高表达患者预后差,存活时间短。


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