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抗EV71单克隆抗体的中和保护作用及机制研究

于晓杰  
【摘要】:肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是手足口病最常见的病原体之一,能引起以发热和手、足、口腔等部位的皮疹、疱疹为主要特征的急性传染病,感染以婴幼儿多见[1],尤其在亚太地区具有明显的发病率和致死率,仅2008年到2012年中国大陆地区多次暴发手足口病,死亡超过2000例,成为严重危及公共健康的问题[2]。EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属[3],其基因组由一条正链单股RNA组成,含有7408个核苷酸,病毒颗粒直径约300,是一个对称的二十面立体球形结构,包含60个由VP1~4四种蛋白拼装的五聚体亚单位,VP1~3三种蛋白各自形成三明治折叠结构相互连接暴露在病毒颗粒的表面,VP4蛋白包埋在病毒衣壳内[4,5]。 目前EV71感染的防治工作面临着很多问题,致病机制和流行趋势尚不明确,临床上既无有效疫苗用于预防感染,又无有效的抗病毒药物用于治疗,疫情在很长时间内难以得到缓解。基于这种现状,研制抗EV71保护性抗体的策略得到了广泛地关注。尽管目前已有研究发现几株抗EV71中和性抗体及中和表位,但保护机制和结构基础依然未知。 本研究利用EV71病毒及其衣壳蛋白联合免疫小鼠,筛选得到14株抗EV71单克隆抗体。ELISA检测了14株杂交瘤细胞上清与EV71病毒灭活疫苗的相对结合力。保护实验证明,14浓缩抗体上清中7株对抑制EV71导致的细胞病变有比较明显的抑制作用,我们进一步将这7株细胞株腹腔注射制备鼠源性抗体并纯化。体外细胞保护试验证明有4株鼠源性单克隆抗体可以有效的降低EV71对RD细胞的侵染,在100ug/ml的浓度时,单抗2G12和12B6能保护60%以上的细胞免于病变。病毒空斑试验进一步验证了这4株单抗对细胞的保护作用。免疫印迹发现7株单抗中有3株均不结合变性状态下的病毒的重组VP1蛋白,提示这3株抗体识别的可能是空间表位。其余4株抗体均可识别VP1上的线性表位。 为明确中和性抗体2G12的作用表位,我们利用噬菌体展示随机十二肽库对2G12进行了表位淘选,筛到一段结合位点215KQEKD219,进一步合成表位肽P2可与2G12特异性结合,并且能够竞争性阻断2G12与EV71的结合。 抗体2G12的中和表位位于EV71外壳蛋白VP1的GH loop区域,有研究表明VP1的GH loop在病毒脱壳构象改变过程中发挥着重要作用。为进一步研究2G12中和性抗体的作用机制,我们全基因合成并表达了EV71细胞受体SCARB2胞外段蛋白。通过ELISA验证了SCARB2胞外段的结合活性,SCARB2可与EV71、VP1蛋白结合,且结合不受抗体2G12的影响。我们进一步将不同条件下病毒感染的细胞采用RT-PCR进行检测,通过计算病毒RNA相对拷贝量我们发现,保护性单抗2G12并不能阻断病毒与受体的结合而是影响了病毒入侵的脱颗粒过程,从而抑制了病毒对细胞的侵染。因此,我们认为中和抗体2G12是通过影响了病毒脱颗粒的关键功能域GH LOOP的构象改变,进而阻碍了病毒RNA释放进入细胞内质,保护宿主细胞免受病毒感染。 本课题筛选获得了四株有效的抗EV71单克隆抗体,鉴定了1株强中和保护抗体的识别表位,并首次从病毒脱颗粒的角度上阐述了2G12单克隆抗体的中和保护机制。为进一步抗体药物的研究和防治EV71感染流行奠定了基础。


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