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负载紫草素的温敏被动靶向纳米胶束的制备及抗乳腺癌作用研究

黄念  
【摘要】:研究目的乳腺癌己成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,占女性新发癌症的29%,是20-59岁女性最大的癌症死因,严重地影响了女性的健康。紫草素(Shikonin)为中药紫草的主要有效成分。体外实验已证实,紫草素具有较强的抗乳腺癌作用。然而,紫草素难溶于水,且体内分布广泛。有研究报道,小鼠静脉注射3H标记的紫草素后,体内分布广泛,含量从高到低依次为胆汁、肝肺、脾、肾、心、皮肤睾丸、肌肉、脑。为提高紫草素对乳腺癌组织的靶向性,本研究合成了具有温度敏感性的嵌段共聚物(Block Copolymer Micelles,BCMs),其能在水中自组装成纳米胶束,负载紫草素载。同时,在肿瘤微环境相对于正常组织较高温度的条件下,增强温敏纳米胶束(Thermosensitive Nanomicelle,TN)的细胞内吞,实现温敏被动靶向。最后,对负载紫草素的温敏纳米胶束(Shikonin-loaded Thermosensitive Nanomicelle,STN)的生物相容性及体内外抗肿瘤作用进行评价。研究方法本研究首先要合成具有温度敏感性的PID118-b-PLA39,使其体积相转变温度(Volume Phase Transition Temperature,VPTT)控制在40℃左右,具有体内外温敏被动靶向功能。通过在水中透析自组装,调节PID118-b-PLA39在水中的结构形态,制备温敏纳米胶束。利用胶束PLA疏水内核紫草素的水溶性,进一步形成STN。接着,利用动态/静态激光光散射仪(Dynamic/Static Light Scattering Instrument,DLS)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)对所制备的温敏纳米胶束的性能和结构进行测定。在体外实验中,首先通过测定温敏纳米胶束与BSA的结合后的粒径分布,测定其血清稳定性。其次,利用倒置荧光显微镜和LSCM观察负载FITC的温敏纳米胶束(FITC-loaded Thermosensitive Nanomicelle,FTN)被乳腺癌MCF-7细胞内吞和富集的程度。通过CCK-8实验评价温敏纳米胶束细胞毒性,以及负载紫草素后的细胞杀伤效果。用流式细胞仪检测STN对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡影响。在体内实验中,通过构建乳腺癌荷瘤裸鼠模型,利用小动物活体成像仪评价负FTN在荷瘤BALB/C裸鼠体内的分布。构建乳癌荷瘤小鼠,观察尾静脉注射STN后,裸鼠体重、肿瘤的大小及生存期的不同。设定组别为:PBS组(Control)、游离紫草素组(Free Shikonin,FS)、STN组(37℃)、STN组(40℃)。研究结果我们成功合成了具有温度敏感性的温敏纳米胶束。体外稳定性试验表明,其在血清中的稳定性良好。倒置荧光显微镜和LSCM结果表明,FTN在40℃的情况下被乳腺癌MCF-7细胞内吞并富集的程度明显强于37℃组和游离紫草素组。CCK-8实验表明,温敏纳米胶束生物毒性较低,但负载紫草素后则能有效杀伤乳腺癌MCF-7细胞,40℃组明显37℃组。流式细胞仪检测结果表明,STN在40℃的情况下,能有效诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。体内分布结果发现,FTN在静脉给药进入裸鼠体内24 h后,可以从小鼠的实体瘤中观察到非常明显的FTN聚集。体内抑瘤实验表明,STN治疗后,乳腺癌实体瘤的生长得到明显的抑制,其增长速度比对照组明显减慢(PBS=3859 mm3,FS=2372 mm3,STN(37℃)=2278 mm3,STN(40℃)=1235 mm3;STN(40℃)vs PBS:p0.001,STN(40℃)vs FS:p0.001,STN(40℃)vs STN(37℃):p0.05)。研究结论该温敏靶向温敏纳米胶束的紫草素载药量较高,具有温度敏感性的被动靶向,能透过血管壁,特异性地富集于乳腺癌组织中,并能够被乳腺癌细胞大量内吞,通过增殖抑制和凋亡协同杀伤乳腺癌。


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